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背景:再生障碍性贫血(Aplastic anemia,AA)简称再障,是骨髓造血衰竭综合征的一种,以骨髓有核细胞增生减低,外周血两系或三系血细胞减少为特征。造血干/祖细胞(Hematopoietic stem/progenitor cells,HSCs/HPCs)的损伤和功能缺陷直接引起骨髓衰竭,导致再障的发病。免疫系统的紊乱是引起HSCs/HPCs损伤和功能缺陷的重要原因,特别是调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)的数量和功能异常,CD4+/CD8+T淋巴细胞的比例倒置,细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)的异常活化。异基因造血干细胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,Allo-HSCT)是重型再障的一线治疗选择,但是当供者来源的免疫细胞将受者组织成分识别为“异己”时,就会发生移植物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD),GVHD是Allo-HSCT最严重的威胁生命的并发症,限制了 Allo-HSCT的临床应用。脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)是从脐带中分离出的异质细胞,具有促进血管生成、促进机体损伤修复,调节机体免疫功能的作用,在糖尿病、肺损伤、肝病和自身免疫性疾病等疾病的治疗中具有广阔的应用前景。传统的体外细胞培养在二维平面进行,随着传代扩增的进行,MSCs逐渐老化,失去其原有的特性。三维培养通过模拟体内的细胞龛环境,促进细胞之间、细胞与基质之间的相互作用,有利于MSCs维持原有的特性,甚至改善细胞的功能。MSCs广泛表达Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)。在不同的炎症环境中,相应的TLR活化可以调控MSC的不同功能。我们前期的研究结果显示,三维培养后可以提高MSC的TLR3的表达。有研究表明,活化MSC的TLR3可增强MSCs对Treg的诱导能力,增强其免疫抑制功能。我们计划通过三维培养改善体外培养UCMSCs的生长环境,增强其分泌活性因子的功能和改善细胞的状态,为临床应用提供更优质的组织工程细胞。通过活化TLR3,研究TLR3活化的三维培养UCMSCs在再生障碍性贫血骨髓移植中的治疗作用,初步探讨其可能的临床价值。研究目的:1.改良UCMSCs的体外扩增培养方式,以获取更优质的治疗用细胞种子。2.建立三维培养体系,研究三维培养对UCMSCs的影响,为MSC的临床应用研究提供更多的理论依据。3.利用改良后的UCMSCs联合Allo-HSCT治疗再生障碍性贫血,比较其治疗作用的优异,并进一步探讨其机制。研究方法:1.用组织块贴壁法提取UCMSCs,用流式细胞术鉴定细胞表面标志,体外诱导细胞分化为成骨、成软骨、脂肪细胞,检测其多向分化的潜能。2.采用聚氟乙烯巢状片作为三维培养的载体,用吖啶橙荧光染色法来观察三维培养下的UCMSCs,用CCK8增殖实验检测UCMSCs的增殖功能。3.采用体外成血管实验,检测并比较不同培养方式的UCMSCs体外促血管形成能力。4.采用软琼脂集落形成实验,检测并比较不同培养方式的UCMSCs体外致瘤倾向。5.采用qRT-PCR检测UCMSCs免疫调控因子和促造血性关因子表达水平。6.采用辐照联合尾静脉输注淋巴结细胞的方法建立再生障碍性贫血小鼠模型。7.采用SCA1+分选试剂盒,从C57BL/6小鼠的骨髓细胞中分选异基因造血干细胞。8.通过尾静脉输注的方法将TLR3活化后的三维培养UCMSCs联合异基因HSCs打到小鼠体内,并对其疗效进行评价。研究结果:1.成功分离UCMSCs,表达特定表面标志,具有三系分化潜能,并成功建立UCMSCs的聚氟乙烯三维巢状培养体系。2.CCK8增殖实验结果表明,三维培养的UCMSCs增殖不活跃。3.通过酶消化法,得到人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),三维培养的UCMSCs体外促血管生成能力明显强于2D组。4.在体外成瘤实验结果表明三维培养未增加UCMSCs体外成瘤风险。5.UCMSCs经过三维培养后,免疫调控因子前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)的表达显著升高,而DL1(Delta-likel,DLl)、吲哚胺2,3-二加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)等因子的表达未见明显上调;促造血相关因子集落刺激因子(Colony stimulating factor,CSF)1、CSF2、CSF3 的表达显著上调,干细胞因子(Stem cell factor,SCF)、血小板生成素(Thrombopoietin,THPO)、白介素(Interleukin,IL)3、促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)的表达未见明显升高。6.造模后,造模组小鼠出现AA表现,骨髓出现明显的空泡化,骨髓有核细胞数量显著减少,髓腔被脂肪细胞填充,小鼠的内脏未见明显的GVHD表现。7.在治疗效果上,3D培养的UCMSCs组在骨髓移植的早期存活和远期疗效方面可能优于2D培养的UCMSCs。8.TLR3 活化+3D 培养 UCMSCs+Allo-HSCT 组和 3D 培养 UCMSCs+Allo-HSCT组症状好转可能优于2D培养UCMSCs组和仅给与Allo-HSCT治疗组。9.骨组织切片H&E染色的结果显示,给与3D培养的UCMSCs治疗的小鼠骨髓有核细胞数明显比其余各组增多,给与UCMSCs治疗的小鼠骨髓有核细胞数较单纯给与Allo-HSCT治疗增多;在各组脏器组织切片未见明显的淋巴细胞浸润。10.在造血祖细胞集落形成实验中,3D培养UCMSCs治疗的小鼠,其骨髓细胞集落形成能力可能优于2D组,且TLR3活化后的UCMSCs治疗组小鼠的髓系多向造血细胞集落形成单位(Colony-forming units-granulocyte,erythrocyte,macrophage,megakaryocyte,CFU-GEMM)形成可能优于其余各组,而仅给与Allo-HSCT治疗的小鼠骨髓增殖能力最弱。结论:1.采用组织块贴壁法成功分离UCMSCs,构建UCMSCs的聚氟乙烯巢状三维培养体系。在本体系中三维结构不促进UCMSCs的增殖,不增加其致瘤倾向。2.聚氟乙烯巢状三维培养体系可提高UCMSCs的促血管形成功能。3.聚氟乙烯巢状三维培养体系可通过增强UCMSCs对免疫调控因子PGE2的表达,影响UCMSCs的免疫调控功能。4.聚氟乙烯巢状三维培养体系通过增强UCMSCs促造血相关因子CSF1、CSF2、CSF3的表达,增强其促造血功能。5.成功建立AA小鼠模型,AA小鼠具有精神萎靡,活动减少,皮毛稀疏,体重下降,弓背,全血细胞减少,骨髓增生减低等典型再障表现。6.UCMSCs能够促进AA小鼠的骨髓移植后骨髓重建;活化TLR3的三维培养UCMSCs可能通过提高促造血相关因子CSF1、CSF2、CSF3的表达,促进AA小鼠骨髓移植早期白细胞形成,增强其免疫功能,可能对提高骨髓移植早期存活有益。