卵巢癌（Ovarian cancer,OC）是女性癌症死亡的第五大原因,是世界上最致命的妇科恶性肿瘤,严重威胁广大女性的身体健康^[1,2]。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）占所有卵巢癌病例的90%,由于缺乏早期且确切有效的筛查法,多数患者被诊断时往往处于癌症晚期,因此上皮性卵巢癌患者的生存率很低。基于2006年至2012年的SEER数据,早期上皮性卵巢癌5年生存率约为92%,而晚期病人的5年生存率不足30%。且更为不幸的是,70%以上的卵巢癌患者被诊断时已经为晚期阶段,癌症病灶已经发生局部或远端转移^[3,4]。为了提高卵巢癌患者的生存率,迫切需要寻找早期检测筛选的方法以及探索疾病晚期阶段更为有效的治疗办法。尽管在过去的几十年时间科学家努力寻找新的血清生物标志物和治疗策略（如基因治疗）,然而对卵巢癌女性进行5年生存率的整体趋势调查表明,近30年间卵巢癌女性的生存率改善甚微^[5]。此外,EOC的高度异质性使得卵巢癌诊断和治疗更为复杂,组织学上定义的亚群,如浆液性、粘液性、子宫内膜样和透明细胞癌等,都有着不同的临床表现和潜在的分子遗传事件^[6]。然而,目前还不清楚哪些遗传因素决定卵巢上皮细胞的分化。因此,要想改善EOC的诊断和治疗就必须提高对EOC发病的分子机制的了解。迄今为止,科学家已经发现多种microRNA（miRNA）分子参与调控卵巢癌的生长^[1,7]。miRNA是指长度约为20-22个核苷酸的单链内源性RNA,其主要作用是参与形成RNA沉默复合物,并作为基因表达的转录后调节因子^[8-10]。miRNA参与转录后调节的机制通常是与靶mRNA的3’非翻译区（UTR）相互作用,通过序列互补而专一性的抑制靶mRNA的表达^[11,12]。现有的研究已经证明miRNA在许多基础的生命活动中起重要作用,如分化、细胞生长、应激反应和细胞死亡,这些过程涉及多种人类疾病,其中包括了恶性肿瘤^[13-16]。miRNAs发挥了癌基因样和抑癌基因样作用。随着研究的深入,miRNAs在调控人上皮性卵巢癌中的关键作用已经被越来越多地了解,例如miR-193a通过抑制人上皮性卵巢癌中的DNA合成而发挥肿瘤抑制作用^[17];miR-212通过靶向肝素结合表皮生长因子抑制上皮性卵巢癌细胞增殖^[18];此外,在晚期上皮性卵巢癌中miR-181a表达上调可以促进上皮-间质转化从而促进卵巢癌的进展^[19]。2002年,科学家发现miR-16在慢性淋巴细胞性白血病中具有抑癌基因样的作用^[20]。在之后的研究中相继发现miR-16与人类脑胶质瘤^[21]、结直肠癌^[22]、膀胱癌^[23]、肝癌^[24]、前列腺癌^[25]和不同类型的淋巴瘤或白血病^[26-27]等疾病发生相关。提高miR-16在肿瘤细胞中的表达水平有助于促进细胞凋亡并抑制癌细胞的细胞周期。已经有研究旨在通过上调miR-16来增强肿瘤的化学敏感性。此外,miR-16也被报道用于调节血管生成^[28]和免疫反应^[29]。针对miR-16的靶向药物的研究也在不断发展。先前已有研究表明miR-16与卵巢癌细胞增殖有关。然而,miR-16是否影响卵巢癌的侵袭和转移仍然不明,本研究旨在探究miR-16在EOC中的表达和作用,与卵巢癌细胞的侵袭和转移的关系及其相关机制。第一部分miR-16在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与不同临床病理特征的相关性目的:检测上皮性卵巢癌患者肿瘤组织中miR-16的表达水平,探讨miR-16与上皮性卵巢癌之间的相关性。方法:以35例EOC患者肿瘤组织标本为研究对象,良性上皮性卵巢肿瘤25例及正常卵巢组织25例作为对照组,通过qRT-PCR检测三组组织样本中miR-16的表达水平,了解miR-16在EOC中的表达特点;此外,通过检测EOC不同临床病理特征分组中miR-16的表达水平,了解miR-16表达是否与上皮性卵巢癌的不同临床病理特征有关。结果:1.EOC肿瘤组织样本的临床病理特征本研究包括了EOC患者共计35例,不超过50岁（≤50岁）的女性患者共计13例,大于50岁（>50岁）的患者共计22例。其中Ⅰ期3例,Ⅱ期5例,Ⅲ期25例,Ⅳ期2例,且多数（约77.14%）的患者为FIGO手术-病理分期的Ⅲ^Ⅳ期。浆液性卵巢癌共23例,其中高级别浆液性癌17例,约占本研究EOC患者的48.57%;低级别浆液性癌6例,约占17.14%;粘液性腺癌6例,约占17.14%;子宫内膜样腺癌4例,约占11.43%;以及透明细胞癌2例,约占5.72%。浆液性卵巢癌是病理组织学中最常见的EOC,本研究中约占65.71%。2.miR-16在上皮性卵巢癌肿瘤组织样本中的表达下调上皮性卵巢癌组织中miR-16的表达水平（0.29±0.13）较良性上皮性卵巢肿瘤组（1.07±0.16）和正常卵巢组（1.04±0.28）均低,差异有统计学意义（P<0.01）;而良性上皮性卵巢肿瘤组和正常卵巢组miR-16的表达水平无明显差异（P>0.05）。3.上皮性卵巢癌不同临床病理特征分组中miR-16的表达上皮性卵巢癌组织miR-16的表达水平与患者年龄及病理组织学分型不相关,差异无统计学意义（P>0.05）;但与肿瘤手术-病理分期和EOC发生二元论类型均相关,其中Ⅲ+Ⅳ期患者miR-16的表达水平（0.26±0.11）低于Ⅰ+Ⅱ期患者（0.41±0.16）;II型EOC患者miR-16的表达水平（0.23±0.12）低于I型患者组（0.36±0.18）,且差异有统计学意义（P<0.05）。小结:1.miR-16在上皮性卵巢癌组织中表达下调,对EOC可能是一种抑癌因子。2.miR-16的表达水平不仅与上皮性卵巢癌手术-病理分期相关,还同EOC发生二元论类型相关,但是与患者年龄和病理组织学分型无关。第二部分miR-16在SKOV3细胞中的表达及对卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响目的:检测miR-16对SKOV3细胞的增殖、迁移及侵袭等方面的生物学作用。方法:通过qRT-PCR检测与卵巢上皮细胞（OEC）相比,卵巢癌SKOV3细胞中miR-16的表达情况,探讨miR-16和上皮性卵巢癌二者之间的相关性;向SKOV3细胞转染合成的miR-16类似物,使其在细胞内过表达,qRT-PCR鉴定表达效果;分别通过CCK-8增殖实验、划痕实验、Transwell侵袭实验检测过表达miR-16对SKOV3细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果:1.miR-16在SKOV3中的表达（0.49±0.03）显著低于其在卵巢上皮细胞（OEC）的表达（1.16±0.06）,差异有统计学意义（P<0.01）。2.转染了miR-16类似物（实验组）和阴性对照（对照组）各24小时后两组SKOV3细胞中miR-16的相对表达量分别为（1.92±0.12）和（1.00±0.11）;48小时后两组SKOV3细胞中miR-16的相对表达量分别为（1.96±0.22）和（1.00±0.21）;72小时后两组细胞中miR-16的相对表达量分别为（1.83±0.09）和（1.00±0.04）,差异均有统计学意义（P<0.01）。3.CCK-8增殖实验显示,转染24h后实验组和对照组OD值分别为（0.60±0.02）和（0.67±0.03）,差异无统计学意义（P>0.05）;转染48h后两组OD值分别为（1.05±0.10）和（1.35±0.08）,差异有统计学意义（P<0.05）;转染72h后两组OD值分别为（1.55±0.07）和（2.12±0.14）,差异有统计学意义（P<0.01）,过表达miR-16抑制了SKOV3细胞的增殖。转染3天后,miR-16的过表达显著抑制了SKOV3细胞的增殖。与对照组细胞相比,miR-16过表达组在转染后24、48、72h的生长抑制率分别为13%、29%、37%。4.划痕实验显示,miR-16过表达显著抑制了SKOV3细胞划痕的汇合,miR-16的过表达组划痕后0h、12h、24h的相对划痕面积分别为（0.94±0.05）、（0.69±0.03）、（0.43±0.01）;阴性对照组0h、12h、24h的相对划痕面积分别为（1.04±0.06）、（0.49±0.02）、（0.21±0.01）。0h两组相对划痕面积无明显差异（P>0.05）;12、24h miR-16过表达组的相对划痕面积均明显大于相应阴性对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）,结果显示miR-16过表达显著抑制了SKOV3细胞的迁移。5.Transwell侵袭实验显示,将转染24小时后各组细胞的侵袭细胞数进行比较,过表达miR-16组的平均每视野侵袭细胞数为（70±10）个,明显少于NC组即（100±20）个/视野,差异有统计学意义（P<0.01）,miR-16过表达显著抑制了SKOV3细胞的侵袭。小结:1.miR-16在人卵巢癌SKOV3细胞中的表达水平下调。2.miR-16过表达抑制了SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3.进一步验证了miR-16在上皮性卵巢癌发生发展中可能发挥抑癌因子的作用。第三部分miR-16抑制卵巢癌细胞侵袭和转移的相关机制研究目的:探讨miR-16影响SKOV3细胞侵袭和转移的过程中可能涉及到的调控方法和信号通路。方法:利用Western blot方法检测在miR-16过表达抑制SKOV3细胞侵袭和转移的过程中可能涉及到的调控方法和信号通路。检测了过表达miR-16后SKOV3细胞中MMP2和MMP9的表达;与EMT相关的E-cadherin、Slug、Snail、Vimentin和Twist的表达;Wnt/β-catenin信号通路中GSK3β、Wnt3a和β-catenin的表达,探讨miR-16抑制卵巢癌侵袭和转移的机制。结果:1.miR-16过表达组和阴性对照组MMP2相对表达水平分别为（0.80±0.08）和（1.02±0.12）,差异有统计学意义（P<0.05）;两组MMP9的相对表达水平分别为（0.45±0.05）和（1.01±0.18）,差异有统计学意义（P<0.01）。与阴性对照相比,转染了miR-16类似物的SKOV3细胞中MMP2和MMP9的表达明显下调。2.miR-16过表达组和阴性对照组E-cadherin相对表达水平分别为（1.63±0.03）和（0.98±0.02）;两组Slug的相对表达水平分别为（0.69±0.10）和（1.06±0.06）;两组Snail的相对表达水平分别为（0.63±0.08）和（1.05±0.05）;两组Vimentin的相对表达水平分别为（0.38±0.01）和（1.01±0.15）;两组Twist的相对表达水平分别为（0.68±0.16）和（1.01±0.15）。miR-16过表达组SKOV3细胞中细胞间黏附分子E-cadherin的表达高于对照组,而间充质细胞标志物Slug、Snail、Vimentin和Twist的表达均低于对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。3.miR-16过表达组和阴性对照组GSK3β相对表达水平分别为（1.85±0.10）和（0.99±0.01）;两组Wnt3a相对表达水平分别为（0.45±0.04）和（1.00±0.06）;两组β-catenin相对表达水平分别为（0.27±0.01）和（1.00±0.11）。miR-16过表达组GSK3β表达高于对照组,而Wnt3a和β-catenin的表达低于对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。小结:1.miR-16过表达可能通过抑制MMP2和MMP9的表达,从而抑制SKOV3细胞的侵袭和转移。2.miR-16过表达可能通过上调上皮细胞间黏附分子E-cadherin的表达,下调包括Slug、Snail、Vimentin和Twist等在内的一系列间充质标志物的表达,抑制EMT过程,从而抑制卵巢癌细胞的侵袭和转移。3.SKOV3中miR-16过表达导致GSK3β表达显著增强,Wnt3a和β-catenin的表达下降,抑制了SKOV3细胞中Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制卵巢癌细胞的侵袭和转移。4.进一步证实miR-16对于上皮性卵巢癌可能是一种抑癌因子,在其发生发展中发挥着抑癌基因样作用,与卵巢癌细胞的侵袭和转移密切相关。结论:1.miR-16对EOC可能是一种抑癌因子,在EOC肿瘤组织和卵巢癌细胞系SKOV3中表达显著下调。2.miR-16的表达水平与患者的手术-病理分期及EOC二元论类型相关,但与患者年龄及病理组织学分型均不相关。3.SKOV3细胞中过表达miR-16使其增殖减慢,迁移和侵袭的能力下降。4.miR-16过表达可能通过抑制MMP2和MMP9的表达,从而抑制SKOV3细胞的侵袭和转移。5.miR-16过表达可能通过上调上皮细胞间粘附分子E-cadherin的表达,下调包括Slug、Snail、Vimentin和Twist等在内的一系列间充质标志物的表达,参与并抑制EMT过程,进而抑制SKOV3细胞的侵袭和转移。6.在SKOV3中miR-16过表达导致GSK3β表达显著增强,Wnt3a和β-catenin的表达下降,抑制了SKOV3细胞中Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制SKOV3细胞的侵袭和转移。7.miR-16与卵巢癌细胞的侵袭和转移密切相关,miR-16在SKOV3细胞中过表达使细胞侵袭和转移的能力下降,进一步验证miR-16对卵巢癌可能是一种抑癌因子。