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研究背景脑出血是威胁人类生命的疾病之一,有很高的死亡率和致残率,对脑出血后继发性脑损伤的防治至今仍缺乏有效手段。过氧物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activatedα,PPARα)是动脉粥样硬化和心血管疾病的治疗靶点,参与调控与高血压、动脉硬化、血脂异常密切相关的炎症因子。然而,PPARα在高血压脑出血中的抗炎作用尚不明确,因此我们选择PPARα的配体--非诺贝特,研究其在脑出血中的抗炎作用,并明确非诺贝特是否通过PPARαα减轻脑损伤。脑出血后的脑损伤涉及脑水肿的形成;红细胞裂解产物血红蛋白、铁的毒性作用;炎症反应及补体系统参与的免疫损伤。在这几方面发现均有一个因子参与其中,就是血红素氧合酶1(HO-1)。此外,NFκB参与了脑出血后脑损伤的病理生理过程,并在这个过程中起到了中心环节作用。因此我们在明确了PPARα的神经保护作用后,选择HO-1和NFκB作为研究对象,评价非诺贝特对HO-1和NFκB的影响,明确非诺贝特是否通过依赖PPARα的方式影响HO-1和NFκB的表达减轻脑损伤。本论文包括以下三部分内容:1.第一部分:非诺贝特增加脑出血大鼠尼氏小体的产生并促进星形胶质细胞的增殖减轻脑损伤。2.第二部分:非诺贝特减轻脑出血后脑损伤的机制研究。3.第三部分:非诺贝特通过激活PPARα通路减轻脑出血后脑损伤的研究。第一部分:非诺贝特增加脑出血大鼠尼氏小体的产生并促进星形胶质细胞的增殖研究目的1.明确PPARαα是否参与了高血压脑出血病人病变部位的病理生理过程,为下一步的研究提供依据;2.明确PPARα配体非诺贝特是否可以减轻脑出血后的脑组织细胞损伤。研究方法1.建立高血压脑出血大鼠模型采用自体血液灌注模拟血肿占位建模。按0.06g/kg腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠,然后将大鼠俯卧位固定于立体定位仪上,在大鼠颅骨顶部正中线右侧旁开3mm处用牙科钻钻一直径为1mm的骨孔。用微量进样器从大鼠尾动脉上抽取约70ul新鲜血液,将其垂直固定于微量进样泵上,使进样器针尖对准骨孔,垂直向下进针5.5mm,相当于大鼠尾状核的位置。70ul新鲜不凝血在10分钟内全部注入大鼠脑内。2.大鼠大脑星形胶质细胞分离首先用戊巴比妥钠深度麻醉大鼠,然后将大脑从颅骨中取出,置于解剖培养基中,使大脑半球分离出来,去除脑膜,再用灭菌的PBS溶液冲洗皮层数次后,用无菌剪刀和镊子将皮质切成小块,将其放入0.25%的胰蛋白酶中37℃下孵育20-30分钟后,用移液器轻柔的上下吸取皮质部分几次利于分离细胞,之后放入离心管中在室温下以720g离心,小心弃去上清,在含有10%FBS和抗生素的DMEM中进行复苏沉淀的细胞团,最后将细胞悬液转移到10厘米的细胞培养瓶中,在含有95%的空气和5%的二氧化碳的湿润孵化器中保持37℃孵育,两天后更换培养基,每天监测细胞的生长情况。星形胶质细胞一般在第7天到第14天之间汇合。3.脑组织石蜡切片制备4尼氏染色切片经脱蜡、再水化、用甲苯胺蓝(sc-253710)染色,然后脱水、透明、封片(具体参照上海Beyotime生物公司试剂盒说明书),封片后,用荧光倒置显微镜进行显微观察,蓝紫色为尼氏小体。显微镜下尼氏小体形态圆而饱满并且细胞核淡染色被视为神经损伤后完整的细胞;而尼氏小体皱缩且细胞核变形染色被视为严重损伤细胞5.免疫荧光染色:将大鼠脑中分离的星形胶质细胞接种在35mm的细胞培养皿中的盖玻片上培养24小时,在3.7%多聚甲醛溶液中固定15分钟后,以0.3%Triton-x-100冰上透化处理5分钟,用anti-GFAP和anti-S100B的抗体4℃孵育过夜,用PBS浸洗后,在室温下用FITC偶联的二抗孵育1小时,用包含1μg/mL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的mowiol封片,DAPI用于DNA染色。图片通过一台连接有冷CCD的奥林巴斯荧光显微镜(日本QICAM)获取,并由QCapture Pro6.0程序处理。6.免疫组化荧光染色对脑出血模型大鼠及非诺贝特给药组大鼠的脑组织切片进行了GFAP蛋白免疫荧光染色,以此反映星形胶质细胞的激活情况。7.Western blot杂交:检测PPARα的蛋白质表达水平。8.总RNA提取和RT-PCR:检测PPARα的mRNA表达水平。9.统计分析:研究结果1.建立脑出血大鼠模型,应用实时定量PCR检测术后24小时、36小时、72小时大鼠血肿周围脑组织中PPARα的mRNA表达水平,结果表明,PPARαmRNA表达水平在24小时内明显上调,然后从36小时开始逐渐减少,72小时最明显。2.在脑出血大鼠动物模型中研究发现,胃内灌注非诺贝特3天后,组织中尼氏小体和星形胶质细胞增加,3.在体外培养的成年大鼠脑星形胶质细胞中也发现,非诺贝特干预后可以促进星形胶质细胞的增殖。研究结论1.PPARαmRNA及蛋白质表达在脑出血后有变化,且有规律性,进一步证明PPARα参与了脑出血病人病变部位的病理生理过程。2.非诺贝特无论在体外还是体内均可以减轻脑出血后的脑组织细胞损伤。第二部分:非诺贝特减轻脑出血后脑损伤的机制研究研究目的选择HO-1和NFκB作为研究对象,评价非诺贝特对HO-1和NFκB的影响,明确非诺贝特是否通过对HO-1和NFκB的作用减轻脑出血后脑损伤。研究方法1.细胞脑出血模型为了在LN-18细胞系中模拟脑出血,在细胞培养基中加入血红素,终浓度为5uM,维持24小时,对照组加入DMSO,Cullin-1为空白对照。2.脑出血后的炎症反应状态脑出血后的脑损伤中炎症反应也发挥重要作用,为了模拟脑出血后的炎症反应状态,在LN-18细胞系中加入LPS(脂多糖)诱导炎性反应。3.Western blot杂交:非诺贝特干预后检测HO-1和NFκB的蛋白质表达研究结果1.应用western blot方法发现非诺贝特干预LN-18细胞系后,可以上调HO-1的蛋白质表达,减少NFκB的蛋白质表达。2.在细胞脑出血模型中,血红素可以诱导NFκB和HO-1的上调3.LPS诱导炎症反应,发现LPS下调HO-1的蛋白质表达并上调基质金属蛋白酶-9的蛋白质表达,而非诺贝特干预后抑制了LPS诱导的HO-1蛋白质水平的下降,阻断了LPS诱导的基质金属蛋白酶9(MMP9)的上调。研究结论从机制上表明非诺贝特在脑出血中的保护效应可能由于HO-1的上调和NFκB的下调发挥作用。第三部分:非诺贝特通过激活PPAR α通路减轻脑出血后脑损伤的研究研究目的1.探讨非诺贝特对HO-1和NFκB表达的影响是否通过PPARα介导。2.明确HO-1和NFκB之间的关系研究方法1.小干扰RNA(siRNA):在NCBI上找到目的基因的Accession Number。本论文中所用siRNA均在网站设计。用50nM的siRNAs转染LN-18细胞系48小时。2.Western blot杂交:干扰PPARα后监测非诺贝特干预后HO-1和NFκB的蛋白质表达的变化研究结果1.在LN-18胶质母细胞瘤细胞中转染PPARα siRNA后可以下调HO-1的蛋白质和mRNA表达,并上调NFκB蛋白质和mRNA的表达。2.在原代星形胶质细胞中,转染PPARα siRNA后可以下调HO-1的蛋白质和mRNA表达,并上调NFκB蛋白质和mRNA的表达。3.在原代星形胶质细胞中发现干扰PPARα后,不仅HO-1的蛋白质表达显著下降,而且还抑制了非诺贝特诱导的HO-1的上调作用。4.非诺贝特诱导的HO-1的上调与NFκB的下调中,HO-1与NFκB之间没有关联。研究结论证明非诺贝特对脑出血大鼠的保护作用是依赖PPARα介导的HO-1表达的上调和NFκB表达的下调完成的。讨论我们的数据表明:1.PPARα参与了脑出血病人病变部位的病理生理过程;2.在脑出血大鼠动物模型中证明胃内灌注非诺贝特后脑组织中尼氏小体和星形胶质细胞增加;3.在体外培养的成年大鼠脑星形胶质细胞中也发现,非诺贝特干预后可以促进星形胶质细胞的增殖。表明非诺贝特无论在体外还是体内均可以减轻脑出血后的脑组织细胞损伤;4.机制探讨表明非诺贝特在脑出血中的保护效应可能由于HO-1的上调和NFκB的下调发挥作用;5非诺贝特对脑出血大鼠的保护作用是依赖PPARα介导的HO-1表达的上调和NFκB表达的下调完成的。本研究的意义在于:1.证明了非诺贝特通过降脂外效应减轻脑出血后的脑损伤,保护神经功能,2.揭示了PPARαα新的作用途径,提示PPARα和HO-1可以作为脑出血治疗的重要靶目标,3.阐明了非诺贝特在脑出血后继发性脑损伤中发挥保护作用的机制,为治疗脑出血提供了新的探索方向,为新药的开发提供了生理和病理生理学的理论基础。