背景和目的:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetic mellitus,DM)患者最常见且最严重的并发症,也是导致终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的重要原因之一,目前尚无有效的治疗手段。随着对DN研究的不断深入,人们意识到及早改善DN的早期病理改变,减少或阻止蛋白尿的发生,对DN的防治具有重要的价值。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,炎症、氧化应激、细胞凋亡、自噬等多种机制可导致足细胞损伤。近期有研究表明足细胞损伤是DN早期病变的关键因素。因此,探索以减轻足细胞损伤,进而干预DN进展为目标的治疗方法,具有重要的临床意义。汉黄芩素(wogonin)是一种从唇形科植物黄芩根、半枝莲根以及夹竹桃科植物神葛茎中分离的黄酮类化合物,具有广泛的生物活性,已证实在炎症、氧化应激、细胞凋亡、自噬等多个方面具有明确的药理效果。鉴于这些机制同样参与足细胞损伤,故汉黄芩素对DM肾脏损伤是否具有防治作用,是否可以通过抑制足细胞损伤进而减轻DM的肾损伤,引起我们的浓厚兴趣。本研究旨在探讨汉黄芩素对DM肾脏足细胞损伤的保护作用及其可能存在的机制,为DN的防治提供新的思路及措施。方法:第一部分:体内实验:以C57/BL小鼠腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)50mg/kg构建糖尿病模型为研究对象,以汉黄芩素(10、20、40mg/kg)进行分组干预。该实验分为6组:正常对照组(NC),单独给药组(wog40mg/kg),糖尿病模型组(DM),低剂量给药组(DM+wog10mg/kg),中剂量给药组(DM+wog20mg/kg),高剂量给药组(DM+wog40mg/kg),每组8只。造模成功(血糖值≥16.7mmol/L)并饲养12周,检测各组小鼠随机血糖、肾重/体重、血清肌酐值及24小时尿白蛋白以观察汉黄芩素对糖尿病肾脏临床指标的影响;用PAS染色和电镜观察各组小鼠肾脏病理变化;通过Western blot检测KIM1及NGAL的表达以明确汉黄芩素对糖尿病肾损伤程度的影响;用免疫组化方法检测足细胞标志性蛋白WT1及Nephrin的表达,Western blot检测WT1、Nephrin及Podocin的表达,实时定量PCR检测WT1m RNA的表达,以明确汉黄芩素对糖尿病肾脏足细胞损伤的影响。体外实验:以小鼠肾脏足细胞作为实验对象。首先通过MTT实验筛选汉黄芩素的最适治疗浓度。然后以高糖处理足细胞为研究模型,以汉黄芩素(4、8、16μmol/L)进行分组干预。该实验分为7组:正常对照组(NC),单独给药组(wog16μmol/L),甘露醇组(MG),高糖组(HG),低剂量给药组(HG+wog4μmol/L),中剂量给药组(HG+wog8μmol/L),高剂量给药组(HG+wog16μmol/L)。提取细胞蛋白和m RNA,Western blot检测WT1、Nephrin、Podocin的表达,实时定量PCR检测WT1 m RNA的表达,以明确汉黄芩素对高糖环境下肾脏足细胞损伤的影响。第二部分:体内实验:采用Western blot检测炎症通路关键蛋白NF-kB-P65的磷酸化,实时定量PCR检测肾脏炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-6 m RNA的表达以明确汉黄芩素对糖尿病肾脏炎症反应的影响。电镜观察小鼠肾组织自噬小体数量的变化;运用Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1、Atg7、P62的表达以明确汉黄芩素对糖尿病肾脏足细胞自噬的影响。运用Western blot检测凋亡关键蛋白Cleaved-Caspase3、抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达以明确汉黄芩素对糖尿病肾脏足细胞凋亡的影响。运用Western blot检测氧化应激NOX家族重要成员NOX1、NOX2、NOX4的表达以明确汉黄芩素对糖尿病肾脏氧化应激的影响。体外实验:该部分实验分为6组:正常对照组(NC),单独给药组(wog16μmol/L),高糖组(HG),低剂量给药组(HG+wog4μmol/L),中剂量给药组(HG+wog8μmol/L),高剂量给药组(HG+wog16μmol/L)。提取细胞蛋白和m RNA,通过Western blot检测NF-kB-P65、P-P65的表达,实时定量PCR检测肾脏炎症因子TNF-α、IL-1βm RNA的表达以观察汉黄芩素对高糖环境下肾脏足细胞炎症反应的影响。电镜观察肾脏足细胞中自噬小体数量的变化,运用Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1、Atg7、P62的表达以观察汉黄芩素对高糖环境下肾脏足细胞自噬的影响。使用流式细胞术检测细胞凋亡水平,用Western blot检测凋亡关键蛋白Cleaved-Caspase3、抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax的表达,使用Tunel染色观察汉黄芩素对高糖环境下肾脏足细胞凋亡的影响。运用Western blot检测NOX1、NOX2、NOX4的表达,使用DCF、DHE检测细胞内ROS和超氧化物水平以观察汉黄芩素对高糖环境下肾脏足细胞氧化应激的影响。使用软件进行汉黄芩素的靶点预测,用分子对接的方法检测汉黄芩素与Bcl-2结合的活性位点,运用CETSA实验检测汉黄芩素与Bcl-2蛋白的结合,运用IP实验检测汉黄芩素可以通过调节Bcl-2与Beclin-1和Bax的结合来调控自噬和凋亡。结果:第一部分:体内实验:(1)糖尿病小鼠血清肌酐值、肾重/体重和24小时尿白蛋白明显升高,汉黄芩素能有效改善上述临床指标的变化;(2)糖尿病小鼠肾脏PAS染色可见肾小球体积增大、系膜基质增生、肾小管上皮细胞萎缩、管腔扩张,肾小球系膜扩张指数和肾小管间质损伤指数评分较正常小鼠显著升高,电镜观察到足突融合、基底膜增厚明显,足突平均宽度(FPW)明显增加,而汉黄芩素能有效改善糖尿病肾脏的上述病理损伤;(3)糖尿病小鼠肾损伤标志蛋白KIM1及NGAL明显增加,汉黄芩素能有效减少其表达;(4)糖尿病小鼠肾组织免疫组化法结果显示足细胞的标志性蛋白WT1及Nephrin的表达降低,同样Western blot检测到WT1、Nephrin及Podocin的表达降低,实时定量PCR检测WT1的m RNA水平降低,以上结果均证实糖尿病小鼠中上述指标明显下降,汉黄芩素能有效减轻糖尿病肾脏足细胞损伤。体外实验:(1)MTT显示,汉黄芩素在浓度为4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L时,细胞活性不受影响,且可以显著恢复高糖处理后的肾脏足细胞活性;(2)同样用Western blot检测WT1、Nephrin、Podocin的表达,实时定量PCR检测WT1m RNA的水平,结果均证实高糖可诱导上述足细胞标志性蛋白表达减少,汉黄芩素可以恢复肾脏足细胞功能。第二部分:体内实验:(1)用Western blot检测NF-κB-P65的磷酸化,实时定量PCR检测炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-6 m RNA的表达,结果表明汉黄芩素可以减轻糖尿病肾脏的炎症反应;(2)Western blot检测肾组织足细胞自噬相关蛋白Beclin-1、Atg7、P62的表达,电镜观察自噬小体的数量,证实汉黄芩素可以激活肾脏足细胞自噬,促进自噬小体形成;(3)Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Bcl-2、Bax,结果发现汉黄芩素可以抑制糖尿病肾脏足细胞凋亡;(4)Western blot检测NOX1、NOX2、NOX4的表达证明汉黄芩素可以抑制糖尿病肾脏氧化应激反应。体外实验:(1)Western blot检测NF-κB-P65的磷酸化,实时定量PCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β的释放,显示汉黄芩素可以减轻高糖诱导的肾脏足细胞损伤的炎症反应;(2)Western blot检测足细胞自噬相关蛋白Beclin-1、Atg7、P62的表达,电镜观察自噬小体的数量,表明汉黄芩素可以恢复高糖抑制的肾脏足细胞自噬;(3)流式细胞术,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Bcl-2、Bax,以及Tunel染色均证实汉黄芩素可以减轻高糖诱导的肾脏足细胞凋亡;(4)Western blot检测NOX1、NOX2、NOX4的表达,以及DCF染色、DHE染色均证明了汉黄芩素可以减轻高糖诱导的肾脏足细胞的氧化应激反应;(5)使用软件进行汉黄芩素的靶点预测发现Bcl-2的拟合值很高,运用分子对接的方法和CETSA实验均证实汉黄芩素和Bcl-2蛋白的结合,IP实验证实汉黄芩素可以通过抑制Bcl-2与Beclin-1结合上调自噬,促进Bcl-2与Bax结合抑制凋亡。结论:(1)汉黄芩素可以抑制高糖引起的肾脏足细胞损伤,改善糖尿病肾脏临床和病理改变;(2)汉黄芩素可以减轻肾组织和足细胞的炎症反应和氧化应激,上调足细胞自噬,抑制凋亡;(3)汉黄芩素可能通过B细胞淋巴瘤-2介导的凋亡与自噬交互作用来调控糖尿病肾脏足细胞损伤。