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骨质疏松症(osteoporosis,OP)为骨的全身性代谢疾病之一，脂肪组织中分离获取的脂肪源干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是间充质干细胞的一种。通过增加机体内未分化的ADSCs，促进成骨分化，从而加强骨重建，可能会在骨质疏松的治疗领域起到相应的作用。 为了探讨异体脂肪源干细胞移植对老年性骨质疏松的预防和治疗作用，本实验通过微型计算机断层成像(microCT)、血清学等检测方法来观测脂肪源干细胞移植对自发老年性骨质疏松模型小鼠(仅有的一种能证明增龄性骨脆性骨折的实验动物SAMP6)体内自由基、血清睾酮、骨钙素、钙、磷、碱性磷酸酶等代谢，以及骨密度、骨生物力学、骨组织形态计量学等方面的影响。 目的： 1、体外分离培养取自SD大鼠腹股沟皮下垫的ADSCs，并对其进行多向分化潜能和表面标志的鉴定; 2、观测脂肪源干细胞移植对自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6的血清睾酮(T)、骨钙素(BGP)、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)等表达的影响，阐述脂肪源干细胞移植抗代谢性衰老的血清学意义; 3、通过检测小鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶，观测ADSCs移植对自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6体内的钙磷代谢及骨形成的影响; 4、通过microCT检测实验小鼠的骨密度和骨微结构，观测ADSCs移植对自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6骨质量和骨组织微环境的影响; 5、通过三点弯曲试验检测，观察移植ADSCs对自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6骨强度及骨刚度的影响; 6、通过骨组织形态计量学观测，评估移植ADSCs对自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6骨内微环境的影响; 7、为干细胞可以治疗代谢性、退行性和衰老性疾病提供部分实验依据。 方法： 1、于2月龄SD大鼠腹股沟皮下脂肪垫取材，以酶消化法来体外分离培养脂肪源干细胞。对5代脂肪源干细胞采用形态学及流式细胞术鉴定（表面抗原CD29、CD90、CD11b、CD49d、CD106和CD45）。第5代ADSCs通过采用定量PCR观察ADSCs在维甲酸诱导下是否能表达生殖细胞相关基因Oct4、Dazl、Nobox、Piwil，进而判断ADSCs是否具有向生殖细胞分化的潜能;并分别经成骨诱导分化和成脂肪诱导分化后，进行相应的茜素红和油红O染色，进而判断所培养的细胞是否为具有多向分化潜能的脂肪源干细胞。 2、20只6月龄雄性自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6、10只6月龄正常同源对照小鼠SAMR1，随机分为SAMR1空白对照组（A组）、SAMP6骨质疏松模型对照组（B组）、ADSCs移植治疗组（C组），每组10只。 3、ADSCs移植干预治疗骨质疏松模型SAMP6:收集原代培养传至第3代的脂肪源干细胞，无菌生理盐水重悬，制成浓度3×106cells/mL细胞悬液。通过尾静脉向每只治疗组SAMP6注射脂肪源干细胞3×106个细胞，而每只模型对照组SAMP6、空白对照组注射1mL生理盐水，4周后检测。 4、实验小鼠采用水合氯醛麻醉（微型计算机断层成像检测后），心脏取血，促凝管接取后在室温下放置8h，离心15min，3000r/min，取上清制备血清，分装后-70℃保存。血清睾酮(T)和骨钙素(BGP)水平测定用放免法;用黄嘌呤氧化酶法测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，硝酸还原酶法测定血清NO，用硫代巴比妥酸(TBA)法测定血清丙二醛(MDA)含量。用全自动生化分析仪分别利用偶氮砷Ⅲ法、磷钼酸比色法和速率法测定血清中钙、磷及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的含量。 5、实验小鼠采用水合氯醛麻醉，利用microCT测定腰椎、右侧股骨和右侧胫骨的三维骨形态计量参数。MicroCT扫描完成后，于距离生长板远端1.0mm选取层厚3.0mm骨组织来对松质骨的感兴趣区域进行三维重建。 结果： 1、光学显微镜观察显示，原代培养的ADSCs在24小时后大部分可贴壁，细胞呈梭形、多边形、圆形等。细胞长势良好，6天后按照1∶3的比例传代，之后每3天传代一次。传至第5代的细胞形态均一，多呈纺锤形或多角形。流式细胞术检测发现CD90、CD29呈强阳性，CD106呈弱阳性，而CD49d、CD45和CD11b呈阴性。在ADSCs成脂诱导培养14天后，油红O染色可显示细胞浆内橙红色的特异性脂滴;成骨诱导培养21天后，茜素红染色可显示呈粉红色的特异性的矿化结节;定量PCR结果显示，经维甲酸诱导后ADSCs能表达生殖相关Oct4、Dazl、Nobox、Piwil四个基因，说明体外培养的ADSCs可以向成脂、成骨、成生殖方向诱导分化。 2、SAMR1空白对照组、SAMP6模型对照组、ADSCs移植治疗组之间的血清睾酮含量比较差异有统计学意义（F=2816.581，P＜0.001），与SAMR1空白对照组比较，SAMP6模型对照组小鼠血清睾酮水平有所降低(P＜0.001)，提示老年骨质疏松小鼠模型已复制成功;与SAMP6模型对照组比较，4周治疗后，ADSCs治疗组小鼠血清睾酮有所提高(P＜0.001)。 方差分析结果显示三组小鼠血清骨钙素(BGP)水平比较差异有统计学意义(F=104.017，P＜0.001)，SAMP6模型对照组小鼠血清BGP水平明显高于SAMR1空白对照组，差异具显著性(P＜0.001);经4周治疗后，ADSCs移植治疗组血清BGP水平较SAMP6模型组有所下降（P＜0.001）。 同时各组整体比较血清Ca(F=105.029，P＜0.001)、P(F=30.858，P＜0.001)及ALP(F=9.446，P＜0.05)均有统计学意义。SAMP6模型对照组与SAMR1空白对照组比较，血清Ca和ALP(P＜0.05)水平明显降低，血清P水平(P＜0.05)则明显上升。与SAMP6模型对照组比较，ADSCs治疗组可显著提高血清Ca和ALP水平，但均低于空白对照组（P＜0.05）;ADSCs治疗组血清P水平则明显低于模型组（P＜0.01）。 并且方差分析结果显示三组的血清SOD(F=235.044，P＜0.001)、血清NO水平(F=286.880，P＜0.001)、血清MDA水平（F=54.327，P＜0.001）比较差异有统计学意义。SAMP6模型对照组与SAMR1空白对照组比较，血清MDA水平显著性升高（P＜0.001），而血清SOD(P＜0.001)、血清NO(P＜0.001)均显著性降低，提示骨质疏松小鼠模型复制成功。相比SAMP6模型对照组，细胞移植治疗后骨质疏松小鼠SOD活性（P＜0.001）、血清NO水平(P＜0.001)有所提高，降低MDA水平(P＜0.001)。 3、SAMR1空白对照组、SAMP6模型对照组、ADSCs移植治疗组之间的骨强度(F=18.013，P＜0.001)、骨刚度（F=35.133，P＜0.001）、腰椎骨密度（F=38.220，P＜0.001）、股骨骨密度(F=70.312，P＜0.001)、骨小梁数量（F=131.291，P＜0.001）、相对体积(F=85.962，P＜0.001)和厚度(F=13.159，P＜0.001)、骨小梁分离度(F=69.714，P＜0.001)、结构模型指数(SMI)(F=600.711，P＜0.001)，各向异性度(DOA)（F=36.804，P＜0.001）、单位骨小梁的破骨细胞数(F=456.168，P＜0.001)显示比较差异均有统计学意义。 结论： 1、腹股沟皮下脂肪组织分离、培养增殖的脂肪源干细胞呈长梭形、多角形，可形成细胞集落。在ADSCs成脂方向诱导分化14d后，油红O染色细胞胞浆内可显示特异性的脂滴;成骨方向诱导分化21d后，茜素红染色可显示呈粉红色的特异性矿化结节;定量PCR结果显示，经维甲酸诱导后ADSCs能表达生殖相关Dazl、Oct4、Nobox、Piwil四个基因;该细胞经定向诱导后体外可以向成生殖、成骨、成脂肪分化，与间充质干细胞多向分化的功能一致。细胞表面标记物检测中，流式细胞术检测发现ADSCs的表面标志物CD90、CD29呈强阳性，CD106呈弱阳性，而CD49d、CD45和CD11b呈阴性。 2、通过移植脂肪源干细胞可显著升高骨质疏松小鼠体内血清睾酮含量、骨钙素水平，可有效改善体内钙、磷代谢，为临床上骨质疏松症的研究和治疗提供了一种新的研究思路和方法; 3、尾静脉移植脂肪源干细胞后，可显著升高骨质疏松小鼠体内血清SOD含量和NO水平，而且有效降低血清丙二醛(MDA)含量。 4、尾静脉移植脂肪源干细胞后，Micro CT检测结合骨组织形态计量学分析（印证可互相补充且高度相关），可见骨质疏松小鼠骨密度、骨强度和骨刚度均明显增加;骨小梁数量增多且变厚、变粗，骨小梁间的连接性改善，陷窝明显减少;骨小梁的数量、相对体积和厚度明显增加，同时骨小梁分离度显著降低，各向异性度有所降低，结构模型指数有所增加，单位骨小梁的破骨细胞数减少。