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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种全身性自身免疫性疾病,其特征在于持续的关节炎症以及骨骼和软骨损伤。RA病程长,致残率高,患者可出现严重的关节畸形及功能丧失,给个人、家庭和社会带来重大的经济负担,已成为十分重要的公共卫生问题之一。目前关于RA的具体发病机理尚未完全阐明。因此,寻找RA的潜在生物标志物,揭示其致病分子机制对提高RA的早期干预和治疗以及临床诊断具有重要意义。lncRNA是一类长度超过200bp的RNA,近年来研究发现lncRNA的失调参与许多自身免疫性疾病的发生和发展[1]。鉴于此,本研究将从以下三个部分来构建RA相关的lncRNA调控网络,探索lncRNA对Jurkat T细胞功能的影响,并筛选和验证lncRNA相关的靶基因。第一部分:运用lncRNA+mRNA表达谱芯片技术,根据FC>2,P<0.05筛选RA病人和健康人群PBMC中差异表达的lncRNA和mRNA,并将差异性最显著的4个RNA在另一独立人群样本中进行验证;第二部分:确定拟要研究的lncRNA,并在活化的Jurkat T细胞中验证其在芯片表达谱的结果,测定其全长,预测编码潜力和亚细胞定位,用慢病毒感染Jurkat细胞构建RNU12敲减细胞株,围绕RNU12敲减细胞株在是否活化的状态下对细胞周期、细胞凋亡的调控,并研究炎症相关的细胞因子的表达,从而通过RNU12对Jurkat细胞分子功能探究与RA的发病机制。第三部分:筛选RNU12的靶基因,并进行独立样本人群和敲减细胞株的验证,用蛋白免疫印迹进行protein水平的验证,构建lncRNA-mRNA-RA调控网络,为RA相关lncRNA参与的具体发病机制进行探索。研究目的:1.通过高通量基因芯片构建PBMC中RA相关lncRNA和mRNA表达谱,筛选最显著的P值在另一独立人群样本中验证。2.RNU12在芯片表达谱和验证人群中显著低表达,进一步围绕RNU12对Jurkat细胞的功能作用研究,探索RNU12作为RA潜在生物标志物的细胞分子功能机制。3.RNU12低表达对Jurkat细胞功能产生影响,并调控炎症相关细胞因子的表达,为了进一步寻找与RA相关的具体的发病机制,寻找RNU12的靶基因。研究方法:应用lncRNA+mRNA芯片技术检测研究对象PBMC中lncRNA和mRNA的表达,通过筛选最显著的P值,选择4个P值最小的RNA在另一独立人群中进行RT-qPCR验证,寻找潜在有研究价值的差异表达的lncRNA。进一步在活化的T细胞中验证RNU12的表达,并用RACE测定其全长,预测蛋白编码能力及亚细胞定位,构建RA相关RNU12敲减细胞株及阴性对照,用CD3/CD28在活化与未活化敲减细胞株的状态下进行Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡及PI染色检测细胞周期的功能研究,并通过qPCR法检测RNU12敲减细胞株中相关炎症细胞因子的表达。通过结合RAPBMC中芯片mRNA靶基因,以及对RNU12敲减株的基因测序和质谱结果,找到有差异的共同重叠的靶基因,并在RNU12敲减细胞株和独立人群样本中进行验证,并进行蛋白免疫印迹实验验证。研究结果:对25名RA患者和18名健康对照人群提取PBMC进行基因芯片lncRNA+mRNA表达谱检测,得到lncRNA探针信息22774条和mRNA探针信息25004条。最终筛出365个lncRNA和883个mRNA在RA病例和对照组之间差异表达,其中,253个lncRNA上调,112个lncRNA下调;共663个mRNA上调,38个mRNA下调。选择4个P值最显著的RNA,在另一独立样本人群(35RA:35Control)中进行RT-qPCR验证,最终验证到新的lncRNA-RNU12(ENSG00000270022)在血样中的表达情况与芯片表达谱结果一致。用不同免疫刺激剂(PHA、PMA、CD3/CD28)刺激Jurkat细胞,发现RNU12在T细胞活化状态下也显著低表达;同时,RACE实验鉴定RNU12为1432bp的RNA,且软件预测其无蛋白编码潜力,是lncRNA,主要位于细胞核。通过成功构建RNU12-SH1、RNU12-SH2、NC敲减细胞株进行细胞功能验证;细胞周期实验结果表明不论是否活化Jurkat敲减细胞株,与对照组相比,RNU12低表达均能使S期阻滞,有抑制Jurkat凋亡趋势,但无统计学意义。此外,RNU12低表达能有效调控IL-1β、TNF-α的表达。用RAPBMC中mRNA表达谱与敲减细胞株中mRNA芯片重叠,根据COR挑选出19个有潜在研究意义的潜在靶基因,进行GO和KEGG分析。在敲减细胞株中多次验证发现c-JUN,CCNL2,PKM,CDK6显著低表达,其中c-JUN和CCNL2与芯片表达谱调控方向一致,在独立人群样本中验证也显著低表达,蛋白免疫印迹验证c-JUN蛋白在敲减细胞株中也呈降低的趋势。但CCNL2在Jurkat细胞株中表达量很低,作用需进一步验证。研究结论:通过运用高通量生物基因芯片技术,发现RA病人与健康人群在lncRNA和mRNA表达谱中差异表达,此外,研究者通过筛选及验证发现了新的lncRNA-RNU12,发现其可能是RA潜在的生物标志物,可能参与RA的发病机制。RNU12低表达在活化与未活化状态下对Jurkat细胞周期有影响,对凋亡可能有影响,对RA相关细胞因子表达有调节作用。证明c-JUN蛋白水平和mRNA水平在RNU12敲减细胞株中均低表达,可构建RNU12-c-JUN-RA调控网络。