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研究背景和目的卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤,其发病隐匿,发现时通常届以晚期。高级别浆液性癌（High-grade serous cancer,HGSC）约占上皮性卵巢癌的70%,其恶性程度极高,预后差,严重威胁广大女性同胞的生命健康。目前,全面的肿瘤细胞减灭和以铂类为基础的联合化疗仍然是HGSC治疗的基石,虽然HGSC在初始治疗中多数表现为铂敏感,但是,随着病程的进展,最终还是难逃复发和铂耐药的厄运。Holliday 交叉识别蛋白（Holliday junction-recognizing protein,HJURP）是染色体特异性组蛋白 H3 变体（Chromosomal specific histone H3-variant,CENP-A）的分子伴侣,多项研究报道HJURP参与DNA双链损伤的同源重组修复过程,在染色质稳定性和肿瘤细胞永生化中发挥重要功能。然而,HJURP在卵巢癌发展和耐药中的作用尚不明确。WEE1是G2期细胞周期检查点,在基因组稳定性和DNA损伤修复中发挥重要作用。AZD1775作为WEE1的特异性小分子抑制剂,已在多项临床前研究中显示出抗肿瘤潜力。综上所述,考虑到HJURP与DNA损伤修复的关系和WEE1抑制剂的基本作用机制,本课题拟探索HJURP在卵巢癌进展和耐药中的作用及其机制,并探讨调控HJURP在AZD1775单药治疗或同顺铂联合治疗中的价值,为耐药或复发性卵巢癌的靶向治疗提供新思路。研究内容和方法本课题通过浆液性卵巢癌和输卵管伞的转录组测序,结合文献复习确定卵巢癌进展密切相关基因HJURP,qRT-PCR和Western blot验证其在输卵管伞和HGSC中的表达。通过组织芯片免疫组化检测HJURP的表达,并验证其与临床病理指标的关系,通过回顾性队列探讨其表达同预后的关系。通过MTT、裸鼠成瘤、流式细胞术等检测HJURP对肿瘤增殖和细胞周期的影响,通过Transwell检测其对肿瘤转移能力的影响。通过MTT梯度加药、平板克隆和流式凋亡等实验检测调控HJURP对卵巢癌铂敏感性的影响,并通过转录组测序及生信分析、相关性分析、Luciferase报告基因实验等多种方法进一步探索其作用机制。通过平板克隆形成和流式凋亡等方法验证敲减HJURP对WEE1抑制剂增敏以及在顺铂和WEE1抑制剂联合用药中的影响。研究结果qRT-PCR和Western Blot显示HJURP在卵巢癌中表达上调,HJURP高表达患者预后较差。敲减HJURP可以抑制卵巢癌细胞的增殖、转移和成瘤能力,周期分析显示敲减HJURP介导早G0/G1期阻滞,Western Blot显示HJURP影响上皮-间充质转化过程。顺铂梯度加药显示敲减HJURP后卵巢癌细胞活性受损更迅速。平板克隆、EdU和流式凋亡检测显示敲减HJURP联合顺铂处理对卵巢癌细胞增殖的抑制或凋亡的诱导作用最明显。γH2A.X免疫荧光显示,HJURP参与顺铂诱导的DNA损伤修复过程。转录组测序及 qRT-PCR 和 Western Blot 验证显示 MYC 和 WEE1 受 HJURP 调控,Luciferase 报告基因实验证实MYC是WEE1的上游转录因子,挽救实验显示HJURP部分通过MYC/WEE1轴导致铂耐药。AZD1775梯度加药和平板克隆实验显示,敲减HJURP对卵巢癌细胞具有AZD1775治疗的增敏作用。平板克隆结果显示,敲减HJURP后,增强顺铂和AZD1775的协同效应。研究结论1.HJURP在卵巢癌中高表达且与多种恶性进展临床指标相关,HJURP高表达患者相对预后不良,敲减HJURP可抑制卵巢癌细胞的增殖和转移能力;2.HJURP间接通过MYC/WEE1轴介导卵巢癌顺铂耐药,敲减HJURP可抑制顺铂诱导的DNA损伤修复过程,且具有增敏顺铂治疗的效果;3.敲减HJURP可增敏WEE1抑制剂的抗肿瘤效应,促进顺铂和WEE1抑制剂联合用药的效果。本研究的创新性1.该研究发现了HJURP在卵巢癌恶性进展中的作用及预后价值,为寻找新的治疗靶点提供了理论基础;2.该研究创新性地发现了在卵巢癌中敲减HJURP对顺铀和AZD1775单药或联合治疗的增敏作用,并发现HJURP介导铂耐药是部分通过MYC/WEE1轴实现的;3.该研究创新性地在卵巢癌中探讨了HJURP在顺铂诱导的DNA损伤修复中的作用,为进一步实现靶向治疗提供了理论基础。本研究的局限性1.本研究为临床前研究,主体研究内容仍处于细胞水平的阶段,动物实验不充分,且未采用病人来源的肿瘤移植模型（patient-derived tumor xenograft,PDX）,距离临床转化尚有较大距离;2. MYC/WEE1轴仅为HJURP参与铂耐药的部分间接机制,尚有其他复杂的调控网络介导铂耐药的产生,本研究未找到HJURP参与的直接靶点,未进行更深层次的分子生物学机制探讨。