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固有免疫(innate immunity)是生物体在物种进化过程中形成的一系列防御机制,能迅速的对侵入的病原体产生非特异性抗感染免疫应答,同时固有免疫在适应性免疫应答过程中也起着重要作用。天然杀伤细胞(natural killer cells, NK)是固有免疫系统的重要组成部分,在机体防御病原微生物感染和抗肿瘤方面发挥着重要的作用。NK细胞的活化受其表面活化性与抑制性受体的协同调控,自然细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptors, NCRs)是NK细胞特有的活化性受体,通常在NK细胞表面抑制性受体丧失识别“自我”能力时,发挥杀伤作用。NKp30(NCR3)是NCR家族的一个重要成员,表达于所有NK细胞表面,在NK细胞活化以及杀伤肿瘤的过程中发挥重要作用,近几年研究表明,NKp30分子参与NK细胞与树突状细胞(dendritic cells, DC)的交互调节(crosstalk),实现对固有免疫和适应性免疫的调控。NKp30分子的功能在过去10年里得到了研究者广泛的关注,但NKp30分子在NK细胞的活化及免疫突触形成中的确切作用机制尚不清楚。本研究中,我们构建了人NKp30胞外段结构域原核细胞表达载体,获得有生物学活性的NKp30重组蛋白。我们采用NKp30重组蛋白免疫小鼠,制备了抗NKp30的单克隆抗体。我们利用免疫荧光、51Cr同位素释放实验、流式细胞术(FACS)和免疫印迹(Western blotting)实验对NKp30分子在NK细胞活化及NK细胞免疫突触形成中的作用进行了研究。主要取得了以下结果:1,NKp30分子胞外段结构域蛋白的表达与纯化构建NKp30胞外段结构域蛋白的原核细胞重组表达载体,通过诱导表达,重组蛋白以包涵体形式存在,经过Western blotting和质谱鉴定,目的蛋白为人NKp30重组蛋白(简称rhNKp30)。分别采用稀释复性法和镍柱亲和层析法对rhNKp30进行复性和纯化,蛋白纯度可以达到95%以上。经FACS检测rhNKp30能够与NKp30配体阳性细胞结合,51Cr释放实验结果显示rhNKp30能够抑制NK92细胞对Hela细胞的杀伤。结果提示rhNKp30具有生物学活性,可用于功能研究。2,抗人NKp30单克隆抗体的制备、鉴定及应用用rhNKp30免疫8-10周龄的BALB/c雌性小鼠,采取不同的免疫策略,经过5次免疫后,取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞在聚乙二醇作用下进行体外融合。通过有限稀释法和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞株,共获得了4株能稳定分泌抗rhNKp30的单克隆抗体杂交瘤细胞株。我们选择了其中对NKp30亲和力高的克隆号为3G5的单克隆抗体进行了深入研究。常规方法制备腹水,经ProteinG亲和层析法纯化获得纯度为95%的单克隆抗体3G5,并对该抗体进行了特性鉴定和应用检测。单克隆抗体3G5能广泛用于Western blotting、免疫沉淀(Immunoprecipitation)、ELISA和FACS检测实验,并且单克隆抗体3G5不影响NKp30受体与其配体的结合。3,NKp30分子参与NK细胞活化及免疫突触形成通过51Cr同位素释放实验检测NK细胞对靶细胞的杀伤,实验结果表明抗NKp30阻断抗体(克隆号:P30-15)能够明显抑制外周血NK细胞或者NK细胞系NK92细胞对多种靶细胞的杀伤。通过筛选发现NKp30分子在外周血NK细胞或者NK92细胞杀伤Hela细胞中发挥着主导作用。为此我们采用NK92细胞作为效应细胞,Hela细胞作为靶细胞进行免疫突触的研究。采用不同荧光标记的抗体的Confocal检测结果显示:NKp30与CD11a分子共定位而且聚集在NK92细胞与Hela细胞的接触面上,提示NKp30分子参与NK细胞免疫突触的形成。通过FACS和免疫荧光检测NK92细胞与Hela细胞的结合显示,在0-15 min内,NK92细胞和Hela细胞的结合率与孵育时间成正相关,在15 min达到最大结合率,15-30 min效靶细胞结合率变化不大。抗NKp30阻断抗体不能抑制效靶细胞的结合,提示NKp30分子不影响NK细胞与靶细胞结合。FACS检测发现,Hela细胞能刺激NK92细胞细胞毒脱颗粒的产生,抗NKp30阻断抗体能显著抑制该效应,提示NKp30分子在NK细胞脱颗粒效应中可能发挥着重要的作用。ELISA检测Hela细胞能够刺激NK92细胞分泌IFN-γ,抗NKp30阻断抗体能明显抑制NK92细胞分泌IFN-γ的水平,说明NKp30分子在NK细胞分泌细胞因子方面起着重要作用。通过Western blotting和51Cr同位素释放实验,发现PI3K-Erk1/2信号通路参与NKp30分子介导的NK细胞活化。综上所述:NKp30分子参与NK细胞活化性免疫突触的形成,但NKp30分子不影响NK细胞与靶细胞的粘附与结合。NKp30分子识别靶细胞上的配体向NK细胞胞内传递活化信号,激活PI3K-Erk1/2信号通路,进而诱导NK细胞的脱颗粒效应与细胞因子的分泌,导致NK细胞对靶细胞的杀伤。