近年来噪声性听力损失(Noise Induced Hearing loss，NIHL)在世界各国发病率居高不下，我国每年新增的职业病病例中有1/6来自于职业性NIHL。目前关于NIHL的发生机制国内外学者已经形成共识，噪声引起耳蜗声音转换、血管纹保持离子平衡及外毛细胞(Outer Hair Cells，OHI)对基底膜调节等耗能活动增多，同时产生大量的活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)诱发的耳蜗氧化应激损伤是NIHL的基本病理过程。 线粒体作为产生能量的细胞器消耗体内90％的氧并产生大量的氧自由基，如果这些活性氧不能被及时清除就有可能引起线粒体和其他细胞器的损伤。锰超氧化物歧化酶(Manganese Superoxide Dismutase，SOD2)主要分布于线粒体基质内，是线粒体内唯一能将超氧阴离子(O2-·)催化为过氧化氢(H2O2)的酶，后者则在过氧化氢酶(Catalase，CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GPx)的作用下降解为水。作为清除自由基的关键酶，人们对，SOD2在氧化损伤中的作用目前尚无统一认识。多数学者认为高水平的SOD2可以促进超氧阴离子的降解，从而保护组织细胞免受自由基攻击。但部分学者根据不少氧化应激相关疾病患者组织或血浆SOD2活力上升的事实，认为高水平的SOD2催化超氧阴离子生成大量的H2O2，当H2O2水平超过下游CAT、GPx的降解能力时，就会促进细胞器和组织氧化损伤的发展。 编码SOD2信号肽(线粒体靶向序列，MTS)的基因序列存在单核苷酸多态性。其编码序列第16位密码子有GCT(丙氨酸，Ala)和GTT(颉氨酸，Val)的互换，即C47T变异(dbSNP数据库收录号：rs4880)。该SNP导致位于SOD2 MTS第16位氨基酸残基丙氨酸(Ala)被缬氨酸(Val)替代。有关研究显示该氨基酸残基在SOD2靶向定位于线粒体过程中起着关键的作用，Ala16→Val16的替换使MTS构像从α—螺旋转变为β—片层，信号肽以丙氨酸作为16位氨基酸时，SOD2线粒体靶向效率明显高于以缬氨酸作为16位氨基酸者，人群研究结果显示该基因位点多态性与很多疾病均有关系但结论不一致。我们前期研究了SOD2单核苷酸多态性与中国接噪工人NIHL易感性的关系，结果发现C47T变异与NIHL易感性有关，该位点携带的C等位基因(Ala16，较高的SOD2线粒体靶向效率)是NIHL的危险因素，但这一研究结果与国外此前的报道并不一致。 鉴于SOD2及其基因多态性与NIHL易感性关系的研究现况以及传统的人群和动物实验方法的不足，本研究拟从NIHL的氧化损伤机制入手，构建SOD2C47T变异高表达细胞株，利用有机氧化剂叔丁基过氧化氢(tert—Butyl Hydroperoxide，t—BHP)染毒耳蜗毛细胞HEI—OC1(House Ear Institue—Organ of Corti 1)建立毛细胞氧化损伤模型，在细胞水平上验证SOD2单核苷酸多态性与耳蜗毛细胞氧化损伤的关系，为SOD2及其SNP与NIHL的关系提供更直接的科学线索。 研究目的: (1)建立HEI—OC1细胞氧化损伤模型。 (2)构建高表达SOD2C47T变异A型和V型等位基因的小鼠耳蜗毛细胞模型。 (3)评价SOD2及其C47T变异在耳蜗毛细胞氧化损伤中的作用，为NIHL遗传易感性的研究提供线索。 (4)为评价其他抗氧化酶基因与耳蜗毛细胞氧化损伤和NIHL易感性的关系建立体外研究方法。 研究方法: (1)建立耳蜗毛细胞氧化损伤模型：光镜观察掌握HEI—OC1细胞一般形态学特点，细胞计数绘制生长曲线；采用t—BHP染毒，设置从30μM到4000μM8个染毒浓度组对HEI—OC1细胞染毒12h，采用台盼蓝染色法检测细胞存活率，并绘制细胞染毒浓度—存活率曲线和100μM浓度组染毒时间—存活率曲线；MTT实验检测细胞增殖能力的改变；DCFH—DA探针法检测胞内ROS水平。通过上述方法筛选出既能在胞内引起较高水平的ROS又对细胞存活、增殖、形态改变等方面影响较小的染毒浓度和染毒时间。 (2)构建SOD2基因多态性耳蜗毛细胞：野生型SOD2(第47位碱基为T)全长ORF(OpenReadingFrame，ORF)哺乳动物表达克隆为广州复能基因公司现货，将SOD2野生型ORF序列通过定点突变后接入该真核表达载体，即可得突变型SOD2(第47位碱基为C)全长ORF哺乳动物表达克隆，该载体已引入Flag标签，可以表达C端Flag标签融合蛋白。通过脂质体转染法将上述两种表达克隆和空对照克隆导入HEI—OC1细胞，采用RT—PCR检测其转录水平，QuantityOne图像分析软件做半定量分析，采用间接免疫荧光法(IndirectImmunoFluorescenceAnalysis，IIFA)检测其融合蛋白表达并计算转染效率。 (3)SOD2基因变异对HEI—OC1细胞氧化损伤的影响：MTT法检测SOD2转染对HEI—OC1细胞增殖能力的影响；黄嘌呤氧化法检测转染组与对照组胞内SOD2活性差异；染毒后，DCFH—DA探针法检测各组ROS水平差异；膜联蛋白V(AnnexinV)与碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)双标记后通过流式细胞仪检测不同转染组细胞早期凋亡和坏死＼晚期凋亡差别。 研究结果: (1)不同浓度的t—BHP对耳蜗毛细胞染毒12h后，100μM以上浓度组细胞存活率开始出现有统计学意义的下降，其中200μM—2000μM浓度组细胞存活率呈直线下降。100μM染毒时间—存活率曲线较为平缓。MTT实验提示30μM的t—BHP染毒可以促进耳蜗毛细胞增殖，200μM以上各浓度组则抑制细胞增殖。DCFH—DA探针法检测胞内ROS水平显示：无染毒细胞镜下无荧光(—)、阳性对照为强荧光(+)、30μM和50μM浓度组则有弱荧光(—+)、100μM染毒组为强明亮荧光(++)、200μM-1000μM各组也有荧光，但随着存活率的迅速降低视野下细胞稀疏。这提示100μMt—BHP对HEI—OC1细胞染毒12h可以很好的建立耳蜗毛细胞的氧化损伤模型。 (2)DNA测序结果显示野生型(Val16)和突变型(Ala16)SOD2哺乳动物表达克隆已被成功构建。脂质体法转染HEI—OC1后，RT—PCR显示野生型和突变型SOD2克隆已经在转染细胞胞内转录，其表达水平均远远高于试剂盒阳性对照(2×105copies/μl)，其与内参相对灰度值分别为：1.20±0.27和1.16±0.26，差异无统计学意义。IIFA显示野生型和突变型SOD2克隆已经成功表达Flag标签融合蛋白，经计算，其转染效率分别为60.2±6.4％，64.2±7.0％，差异无统计学意义。 (3)MTT法显示SOD2表达质粒和空质粒转染不影响HEI—OC1细胞的增殖能力；转染后，各组HEI—OC1胞内SOD2酶活力分别为(U/ml)：未转染对照组，10.5±2.6；空质粒对照组，11.7±1.3；Ala16SOD2转染组，36.9±2.3；Val16SOD2转染组，39.0±5.2。Ala16SOD2和Val16SOD2转染组SOD2活力分别是转染对照组的3.51和3.71倍，差异有统计学意义，两种不同基因型间SOD2活力差异无统计学意义。 (4)100μMt—BHP对未转染对照、空质粒对照、Ala16型SOD2转染(突变克隆)、Val16型SOD2转染(野生克隆)HEI—OC1细胞染毒12h后，DCFH—DA探针检测各组细胞ROS水平，未转染对照、空质粒对照组绝大部分细胞均发出++级明亮荧光，Ala16型和Val16型SOD2转染组中均只有一半左右细胞发出—+～+级别的模糊荧光，显示转染SOD2可以抑制t—BHP引起HEI—OC1胞内ROS水平的上升。AnnexinVPI双染HEI—OC1细胞后经流式细胞仪测定细胞早期凋亡率和坏死＼晚期凋亡率分别为(％)：未转染对照组，20.5±2.8和17.9±1.3；Ala16SOD2转染组，10.4±1.0和6.8±2.8；Val16SOD2转染组，10.2±0.7和6.3±0.1。和未转染对照相比，转染SOD2后，HEI—OC1细胞早期凋亡率和坏死＼晚期凋亡率均下降(P<0.001)，但是其在SOD2两种基因型之间的差异无统计学意义(P>0.05)。 研究结论: (1)100μM的t—BHP对HEI—OC1细胞染毒12h可以在不影响细胞外形、增殖能力的前提下较为显著地提高胞内ROS水平，从而模拟噪声对耳蜗毛细胞的氧化应激损伤。 (2)成功构建了高表达SOD2C47T变异Ala16型和Val16型等位基因的耳蜗毛细胞株。 (3)SOD23.71倍以下高水平的表达可以降低氧化应激耳蜗毛细胞胞内ROS水平，改善其存活状况，而SOD2C47T变异则对之无影响。结合前期人群实验，可以认为SOD2为NIHL易感基因，rs4880多态性位点则与NIHL遗传易感性无直接功能性的相关。 (4)建立了研究抗氧化基因与耳蜗毛细胞氧化损伤关系的体外实验方法，为NIHL易感性的研究提供了新的思路。