背景和目的胆固醇是广泛存在于真核细胞中对细胞的生长繁殖至关重要的脂质分子,过多时则改变化学结构变得不溶于水从而对细胞有毒害作用,一旦胆固醇在动脉壁蓄积就不容易再被动员利用,形成动脉粥样硬化以致发展成冠心病。动脉粥样硬化斑块中的脂质主要是低密度脂蛋白（LDL）,因此研究胆固醇,尤其是LDL胆固醇的代谢,对预防和治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病尤为重要。在正常细胞内胆固醇代谢依靠几种平衡机制,包括内质网中的甾醇调节因子结合蛋白（SREBP）介导的胆固醇合成,由酰基辅酶A;胆固醇酰基转移酶（ACAT）介导的胆固醇酯化和转化成类固醇激素、胆汁酸等。其中在SREBP信号通路中尼曼匹克蛋白1型（NPC1）的作用是把LDL胆固醇转运到内质网中经ACAT酯化和被SREBP裂解激活蛋白（SCAP）感知,来调节胆固醇的代谢,但是目前的文献资料中有关NPC1的确切作用尚未明确,甚至颇具争议。本文的主要目的是应用尼曼匹克（NPC）病细胞明确NPC1是否真的参与了LDL胆固醇向内质网SREBP∶SCAP复合体的转运,通过分析NPC1缺陷细胞在LDL胆固醇存在与否的情况下对SREBP信号通路的影响来说明这个问题。本文的新颖之处在于我们采用比以往文献中更直接的方法测定SREBP活性。如果NPC1参与了LDL胆固醇向SREBP∶SCAP复合体的转运,可以认为其在胆固醇向ACAT和SREBP的转运中都起作用,这将为在NPC病中SREBP的活化和ACAT的活化有联系提供直接证据。如果在NPC1缺陷细胞中LDL胆固醇向SREBP∶SCAP的转运是正常的,这将证明ACAT酯化并不能反映可以由SCAP感知的胆固醇的储备量,这也将证明胆固醇转运至SREBP∶SCAP复合体和ACAT的路径不同。本文的另外一个目的是进一步明确在NPC病中LDL胆固醇对Akt磷酸化的作用。方法为了研究NPC1缺陷时胆固醇的代谢调节,我们采用两种功能缺陷模型。第一种是用药物诱导NPC病,第二种是用NPC1缺陷的细胞株,进一步明确LDL在此病中的作用。1.药物诱导NPC1缺陷;用文献报道中的药物,U18666A、黄体酮等来处理细胞,引起LDL胆固醇在溶酶体中的聚集,减少胆固醇的酯化,模拟NPC病。2.构建NPC1突变细胞株;诱导中国仓鼠卵巢细胞（CHO K1）突变构建两种NPC1缺陷细胞株,2-2和4-4,并建立稳定表达PLAP-BP2的野生型（CHOK1）和NPC1突变细胞株。3.细胞培养;细胞分别在相应的培养基中,37℃,5%CO2培养成单细胞层,加入不同浓度的药物刺激细胞,检测各种指标。4.采用Wallac Microbeta光度计测发光强度,通过测定细胞分泌的胎盘碱性磷酸酶（PLAP）来推测SREBP的活性。5.在培养基中加入2μCi[1- ¹⁴C]油酸与细胞共同培养,采用薄层色谱仪（TLC）分析胆固醇的酯化,证明U18666A的确能模拟NPC病,加入1μCi[1- ¹⁴C]醋酸与细胞共培养来检测胆固醇的合成。6.采用胆固醇的Filipin染色来定位胆固醇在细胞内的位置。7.实时定量聚合酶链式反应（QRT-PCR）检测细胞中SREBP靶基因LDL受体和HMG-CoA还原酶mRNA表达。8.Western Blot分析磷酸化的Akt和总Akt,研究NPC病是否与此通路有关。9.荧光显微镜来定位SREBP∶SCAP从内质网向高尔基体的转运,明确在U18666A和黄体酮处理后稳定表达GFP-SCAP的细胞中加入LDL时SCAP的位置是否受到NPC1的影响。10.统计学处理;图表中显示的数值代表3个实验或如图表说明中的几次重复试验的均数±标准差。采用SPSS11.0统计分析软件,多因素方差分析（ANOVA）来检验LDL,25-羟基胆固醇,U18666A,LY295427和黄体酮对PLAP分泌的影响。两样本的Student t检验用来分析LDL对野生型、抑制剂诱导的和突变型细胞株中mRNA各自表达的影响并两两比较。比较由Microsoft Excel 2003的数据分析功能完成,p≤0.05为有显著性差异。结果1.U18666A对SREBP活性影响的分析药物U18666A来处理稳定表达PLAP-BP2融合蛋白的细胞株13A/PS模拟NPC病,并将不同浓度的LDL加入细胞中测量分泌PLAP的变化来表示SREBP的活性。用25HC作为阳性对照,LDL浓度的升高显著地抑制了PLAP-BP2的裂解,用U18666A处理的细胞培养物表现出与没有处理的细胞培养物相似的结果。这与通常的概念NPC1影响SREBP的作用,也与原先很有威望的理论,应用PLAP-BP2瞬时转染的结果不同。2.用LY295427检验SREBP活性分析在不存在LY295427的情况下,升高25HC的浓度能够减少PLAP的生成,产生PLAP的量反映氧化固醇抑制SREBP的能力。加入LY295427并没有阻止PLAP生成表明它阻止了25HC对SREBP的抑制作用,说明我们的SREBP活性分析方法是正确的。3.U18666A和黄体酮对内质网中胆固醇酯化的影响在对照组细胞中,可以发现LDL诱导胆固醇的酯化。与未处理组相比,U18666A和黄体酮都使LDL负荷的细胞显示出较低的胆固醇酯化。4.U18666A能引起细胞内LDL胆固醇的聚集细胞内胆固醇的Filipin染色显示,在没有LDL和U18666A的情况下胆固醇主要存在于细胞膜上。单用U18666A不用LDL时引起轻度的胆固醇聚集,可能是溶酶体。单用LDL时胆固醇主要存在于细胞膜和近核处,也许就是高尔基体。当细胞与U18666A及LDL共培养时,可见许多明亮的小斑点簇显示胆固醇聚集在细胞的溶酶体中,同时也有少量的胆固醇见于质膜,显示在U18666A存在的情况下,胆固醇运送到质膜障碍,能模拟NPC病。5.用Sigma U18666A刺激细胞所得的重复试验重复试验的的结果显示了与前面的实验同样的趋势,即在U18666A存在与否的情况下,SREBP活性对LDL刺激的反应大致相同。6.黄体酮对SREBP活性的影响在有或无黄体酮的情况下,用LDL处理细胞能进一步显著减少PLAP的产生,再次证明了用U18666A试验的结果。作为阳性对照的25HC在黄体酮存在与否的情况下均能减少PLAP的分泌。7.13A/PS的时间曲线时间曲线检测用美伐他汀处理13A/PS细胞在有或无25HC时PLAP-BP2的分泌情况。在药物作用8小时以内,两种情况下PLAP的生成量相近,直到16小时才发现两种条件下的PLAP生成量有了显著差别,显示对PLAP-BP2的分析至少要在8小时后才敏感。8.稳定表达PLAP-BP2的NPC1突变细胞株的建立我们试图建立稳定表达PLAP-BP2的NPC1突变细胞株,但是在有或无25HC的情况下没有哪种细胞能够在有或无胆固醇的情况下产生连贯和显著的PLAP生成（结果未显示）。因为时间限制这种方法被放弃了。9.SREBP靶基因LDL受体mRNA的表达用25HC作为阳性对照,在有或无U18666A时用LDL刺激细胞,用QRT-PCR来检测LDL受体基因在NPC1突变细胞株2-2和4-4以及野生型CHOK1细胞中的表达。结果发现药物诱导的NPC病细胞和NPC1突变细胞株都对LDL胆固醇不是很敏感。10.SREBP靶基因HMG-CoA还原酶mRNA的表达与LDL受体相似,我们发现在药物诱发的NPC病细胞和NPC1突变细胞株中,用QRT-PCR检测到HMG-CoA还原酶的表达对LDL水平的反应也不是很敏感。11.胆固醇合成的功能测定在有或无LDL或25HC存在的情况下,CHOK1,2-2和4-4细胞与含有[¹⁴C]-醋酸,胆固醇合成的前体物共同培养来测定胆固醇的合成功能。在野生型CHOK1细胞中,胆固醇合成的量由于LDL的刺激减少一半,25HC处理的细胞中胆固醇的合成量几乎为零,2-2细胞株合成的胆固醇最少而4-4合成的胆固醇最多。然而,与野生型细胞株相比,两种突变细胞株均显示了对LDL胆固醇水平的反应降低。12.NPC1缺陷引起的胆固醇调节紊乱不影响Akt通路我们做了Western Blot来显示CHOK1,2-2和4-4细胞中磷酸化的Akt和总的Akt在有或无LDL时的表达情况。光密度法测定结果显示,Akt磷酸化只是在NPC1突变细胞中有很轻微的减低而在野生型细胞中不受LDL胆固醇的影响,说明NPC1缺陷细胞中Akt的表达正常。13.在药物诱发的NPC病变条件下GFP-SCAP的移动用LDL刺激能稳定表达GFP-SCAP的CHO/pGFP-SCAP细胞,在NPC病症条件下用直接免疫荧光法定位GFP-SCAP来分析其甾醇感应能力。在没有LDL存在的情况下,可见细胞近核处有GFP-SCAP染色,可能就是高尔基体。用LDL处理细胞显示了更多的融合的网状染色结构,也就是内质网。U18666A在有或无LDL的情况下刺激CHO/pGFP-SCAP细胞株并与对照组比较的结果显示,在没有LDL存在时,用U18666A处理细胞,可见染色的GFP-SCAP大多聚集在近核处,与对照组细胞大致相同,然而可见稍微多的网状染色。在LDL存在的情况下,U18666A引起SCAP更多地转运到高尔基体。用U18666A处理过的细胞中SCAP停留在高尔基体长达12小时,然而到了24小时这种作用就消失了。说明SCAP感知LDL胆固醇水平的能力延迟。结论1.本研究显示NPC1在LDL胆固醇转移至内质网的过程中起作用,通过SCAP感知胆固醇水平直接作用于SREBP,这就形成了一个先例,LDL衍生的胆固醇由ACAT酯化和胆固醇向SREBP∶SCAP的转运在NPC病中成对出现,这样就证明了ACAT酯化反映了在NPC1缺陷细胞中SREBP的活性。2.NPC1缺陷引起细胞内LDL衍生胆固醇平衡调节的障碍。本文说明NPC1缺陷引起LDL胆固醇向内质网中SREBP∶SCAP复合体转移的延迟,所以也直接显示了有功能的NPC1在LDL胆固醇向SREBP∶SCAP的转移是必需的。3.本研究同时也显示了当NPC1缺陷时,LDL胆固醇还可以通过另一条途径到达SREBP∶SCAP复合体,因为LDL最终还是能够到达内质网被感知的。这可能与从胆固醇储备池中的外溢浸润有关和/或LDL胆固醇通过另一条比NPC1慢的通路转运。4.用羟化固醇的实验给我们这样的启示,它将成为对于NPC病人可能的治疗方法,因为它的作用是恢复胆固醇的平衡,同时也显示羟化固醇能够在NPC1缺陷细胞中调节胆固醇的平衡,成为这种疾病的可能治疗措施。