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钙离子是重要的第二信使，在细胞生长、分化过程中起着重要的作用，Ca2+／CAM可磷酸化多种酶，其中钙离子／钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是其重要靶分子。CaMKⅡ是一种多功能的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，广泛分布表达于多种器官组织，可在体内磷酸化40多种具有重要生理功能的蛋白分子包括酶、离子通道、转录因子等等：CaMKⅡ可以调控碳水化合物、氨基酸、脂肪的代谢，神经递质的合成与释放，转录因子的转录，细胞骨架的构建，细胞周期的进程，DNA损伤的修复等等生理病理过程。近年来有些研究结果提示CaMKⅡ在细胞的生长、分化过程中起着十分重要的作用，也有人认为CaMKⅡ是细胞周期顺利进行的必需分子。 CaMKⅡ抑制剂的发现和应用是研究CaMKⅡ生理功能的有效途径。CaMKⅡ抑制剂可通过与Ca2+／CAM结合位点的相互结合或影响催化功能来抑制CaMKⅡ的活性，从而阻断CaMKⅡ对其底物的磷酸化或调节某些基因的转录，诱导肿瘤细胞发生凋亡、坏死、生长阻滞，该方面研究可为临床肿瘤治疗提供新的策略和方向。因此，发现新型CaMKⅡ抑制剂是一项很有理论探索意义和临床应用价值的工作。本文所研究的新型人钙／钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制蛋白hCaMKⅡNα就是一种我们自主发现的具有功能的新型内源性人CAMKⅡ抑制蛋白。 一、hCaMKⅡNα的克隆、序列分析及组织细胞分布 我们利用本室以往从人DC cDNA文库中克隆到的内源性人CaMKⅡ抑制剂hCaMKⅡNβ（AY037149）序列，在EST库中进行序列比较和拼接，得到一个同源的人cDNA序列。根据该序列设计引物，从人胚胎脑中克隆到一个与已知序列不同的全长新基因，经DNA测序，其开放阅读框架（ORF）编码一个包含78个第二军医大学硕士学位论文中文摘要氨基酸残基的蛋白。同源性分析证实，该编码蛋白与CaMKll抑制蛋白家族成员高度同源，因此根据该家族同源蛋白的命名规则其将之命名为hCaMKllN二。hCaMKllNa序列已在基因库（GenBank）登录（登录号AY204901），并申请国家发明专利（国家发明专利申请号:03 1 5 1 428.6）。蛋白结构分析发现，hCaMKllNa蛋白分子内部靠近C端包含一个在CaMKn抑制蛋白家族成员中保守的由27个氨基酸残基组成的抑制序列（27肤保守抑制区）。已往实验证实，这27个氨基酸所组成的保守抑制序列在CaMKll抑制蛋白抑制CaMKn活性过程中起着决定性的作用。 RT-PCR分析结果表明hCaMKI困a mRNA表达于某些实体肿瘤细胞中，如乳腺癌细胞MCF一7、胶质瘤细胞A172、宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞SMMC7721、前列腺癌细胞PC一3、肺癌细胞A549、卵巢癌细胞CaoV-3等;hCaMKllNa mRNA还表达于某些造血系肿瘤细胞中，如组细胞白血病细胞U937、慢性髓系白血病细胞K562、B淋巴瘤细胞Daudi。但LoVo和HT-29两种结肠腺癌细胞系未见hCaMKllNa mRNA表达。我们同样利用PCR检测了hCaMKllNa mRNA在正常成人组织中的分布，结果发现在心脏、脑、脾脏、肾脏、胎盘、肺脏、肝脏、卵巢、翠丸、小肠、结肠、前列腺、胸腺、外周血均有表达，在脑、肾脏、小肠、结肠表达量较高，在胎盘、心脏、胰腺、脾脏、翠丸低表达，但在骨骼肌中却未见表达。通过对hCaMKI俐a表达水平和分布情况的研究，提示hCaMKIrNa是一种相对广泛表达的分子，在正常和异常的组织细胞中具有一定的表达分布模式。二、CaMKllNa和CaMKn的相互作用以及27肚保守抑制区的功能分析 既然CaMKllNa属于CaMKH抑制蛋白家族，那么CaMKllNa有可能与其它抑制剂一样，通过特异性结合CaMKll，从而抑制CaMKn对其作用底物的磷酸化，在调控多种生理和病理活动中发挥生物学效应。 为了证实这一假设，我们表达了hCaMKnN。的重组GST融合蛋白，通过共沉淀试验检测到在体外GST一hCaMKI取仪融合蛋白可结合活化状态的CaMKHa。同时我们构建了CaMKlla、hCaMKI创a的真核表达载体，共转染于LoVo细胞，通过共第二军医大学硕士学位论文中文摘要沉淀试验检测到在胞内钙离子浓度升高的情况下，hCaMKllNa在体内能够与活化状态的CaMKna结合。为进一步证实hCaMKJINa和CaMKna的结合，我们构建了hCaM心取a与绿色荧光蛋白GFP的融合表达载体，并转染到LoVo细胞中，通过共聚焦显微镜检测发现，在胞内钙离子浓度升高的情况下二者的定位均发生改变，原分布于胞核及胞浆的hCaMKllNa和分布于胞浆的CaMKna均聚集在胞核及胞膜周围发生共定位。因此，实验结果证实hCaMEJINa在细胞内、体外均可结合活化的CaMKll，这就为hCaMKllNa能抑制CaMKn对底物的磷酸化奠定了结构基础。 我们的实验结果己证实hCaMKllNa可结合活化的CaMKll。那么hCaMKI创a分子内部靠近C端所包含的27肤保守抑制区在与CaMKfl的结合过程中起到什么作用?在hCaM心INa的分子内部是否存在一个与CaMKn特异结合的区域?为此，我们将部分缺失和完全缺失27肤保守抑制区的hCaMKI取a真核表达载体与CaMKna的真核表达载体共转染于LoVo细胞，通过免疫共沉淀检测发现，完全缺失或部分缺失 27肤保守抑制区的hCal近KllNa均可以结合活化状态的CaMKlla。因此，我们认为27肤保守抑制区并不是与CaMKna的结合区域，在介导结合过程?