瓦伦西亚烯是一种存在于各类柑橘果实中的萜类化合物,由于其较好的生物活性和香气,被广泛应用于香水、香皂、食品和饮料等的工业制造上。但由于其自然含量极低,且目前制备瓦伦西亚烯的方法较为麻烦且花费高,不利于瓦伦西亚烯的大量应用,因而构建细胞工厂进行瓦伦西亚烯的生物合成是更为高效和环保的方法。酿酒酵母作为普遍公认安全(GRAS)的真核微生物,目前已被大量用于各类天然化合物的生物合成,且其体内拥有内源萜类化合物的合成途径Mevalonate(MVA)途径,所以是构建瓦伦西亚烯细胞工厂的理想平台。本研究首先在酿酒酵母体内引入来自黄扁柏的瓦伦西亚烯合成酶基因(CnVS),使得酿酒酵母细胞可以利用简单碳源合成瓦伦西亚烯,其初始产量为3.03 mg/L(1.8 mg/g DCW)。为了提高瓦伦西亚烯产量,本研究利用CRISPR/Cas9系统对MVA途径进行改造,但该系统涉及多重基因编辑时会受到gRNA表达质粒上的筛选标记限制,为解决该问题本研究基于Cre/loxP系统构建了可回收型质粒,通过半乳糖诱导可实现该质粒在细胞体内的丢失和筛选标记的回收,从而有利于下一轮基因编辑。基于上述可回收型质粒,本研究构建了靶向不同基因的gRNA表达质粒对MVA途径进行改造,包括下调erg9,敲除rox1、bts1等代谢支路的基因,共获得涉及5个不同基因的31株基因敲除突变菌株,其中以下调erg9、敲除rox1为组合的突变株产量最高,达到5.65 mg/g DCW。为了提高瓦伦西亚烯前体farnesyl pyrophosphate(FPP)的供应量,本研究同时在酿酒酵母基因组上过表达了FPP合成途径上的关键基因,使得瓦伦西亚烯产量达到了9.35 mg/g DCW。除了提高通往瓦伦西亚烯的代谢通量,瓦伦西亚烯合成酶的活性也是瓦伦西亚烯产量的限制性因素。因而本研究构建了一系列含不同启动子终止子的瓦伦西亚烯合成酶表达盒,并通过摇瓶发酵验证产量,发现以HXT7为启动子的表达盒产量最高。通过将该表达盒引入上述FPP合成途径过表达菌株中,实现了22.67 mg/g DCW的产量。为进一步提高产量,本研究将摇瓶产量最佳的菌株进行上罐补料发酵,瓦伦西亚烯最高产量达到539.32 mg/L(99.06 mg/g DCW),对比初始菌株实现了约55倍的提升。本研究通过综合利用不同代谢策略实现瓦伦西亚烯在酿酒酵母体内的高表达,也为利用微生物表达其他高价值化合物提供了重要参考意义。