论文部分内容阅读
本实验主要包括两部分，第一部分运用聚合酶链式反应扩增片段多态性（PCR-FRLP）结合序列分析的方法对东海10种鱼类体内寄生的926条异尖属线虫幼虫进行分子鉴定。第二部分利用聚合酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）对东海鱼类十个种群寄生的派氏异尖线虫mtDNAcox1基因序列行群体遗传结构分析，主要结果如下：1.东海鱼类寄生异尖属线虫分子鉴定对rDNA ITS区经HinfⅠ酶切，产生三种不同的酶切带型，分别对应派氏异尖线虫（903条）、典型异尖线虫（2条）和重组基因型（21条）。将三种幼虫的代表性样品经HhaⅠ和TaqⅠ酶切后，得出的结论与前者一致。挑选5个派氏异尖线虫样品，1个典型异尖线虫样品以及全部的重组基因型进行ITS-1区和ITS-2区测序，经序列分析，酶切结果为派氏异尖线虫的样品与GenBank上已发布的派氏异尖线虫序列相同，再次证明为派氏异尖线虫，酶切结果为典型异尖线虫的样品与GenBank上已发布的典型异尖线虫序列相同，再次证明为典型异尖线虫。21条重组基因型的ITS-1区出现了两种序列，一种在280bp处和296bp处个存在以个C/T的重叠峰，定为重组基因型Ⅰ型（RecⅠ），与Abollo等和史梅青的结果一致；另一种只在296bp处存在一个C/T的重叠峰，定为重组基因型Ⅱ型（RecⅡ），与史梅青在渤海报道的一致。两种重组基因型的mtDNASSU序列分析，结果显示RecⅠ和RecⅡ的SSU序列与派氏异尖线虫完全一致，与简单异尖线虫存在三个位点的差异，因此重组基因型的母本来自派氏异尖线虫。因为在东海未发现简单异尖线虫，因此重组基因型有可能是一种古老的多态性保留。2.东海鱼类派氏异尖线虫群体遗传结构分析东海鱼类903条派氏异尖线虫按照宿主分为10个种群，分别是As、Tr、Ps、Lo、Ze、Sa、Pn、Tra、Sc、和Br，通过DGGE结合序列分析，共得到10个单倍型（Hap1-Hap10）。mtDNA cox1基因序列长度均为384bp，共有14个多态性位点，包括3处颠换和11处转换。10种单倍型的碱基组成基本一致，A+T的含量明显高于G+C的含量。通过对十个种群的分子方差分析结果显示，在种群的遗传变异中，种群内远远高于种群间，占97.75%。在对十个种群的遗传分化系数以及Fst值的P检验中显示，Ps与Sa、Tra的Fst值分别为0.32308和0.25824，都大于0.25，说明Ps与Sa、Tra遗传分化程度极高，且Ps与Sa、Tra的Fst值的P检验值分别为0.06306和0.01802。Ps与Lo、Ze， Br与Ze、Sa、Tra遗传分化系数较大，Fst值在0.15759～0.23430之间，且Ps与Lo、Ze， Br与Ze、Sa、Tra的Fst值的P检验都表现出了明显差异（P<0.05）。其他多数种群间的分化系数在0～0.15之间，表明这些种群间有遗传分化程度较弱或处于中等水平。还有部分种群间的遗传分化系数为负值，Fst值的P检验没有显著性差异，说明这些种群间没有遗传分化。根据系统树分析显示，十种单倍型明显的分为两支，一支包括Hap1、Hap4、Hap8、Hap9、Hap10，另一支包括Hap2、Hap3、Hap5、Hap6、Hap7。Hap1和Hap2分别位于两个不同的分支中，而这两种单倍型在所有的宿主种群中均有分布，因此东海派氏异尖线虫没有表现出宿主的特异性。