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第一部分小鼠脑出血后脑组织中血小板源性生长因子受体-β及其配体血小板源性生长因子-BB的表达变化目的:应用小鼠脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)模型,探讨小鼠脑出血后不同时间点血小板源性生长因子受体-β(Platelet-derived growth factor receptor-β,PDGFR-β)及其配体血小板源性生长因子-BB(Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)的表达变化情况。方法:将42只8周大小、重量约30克的雄性CD1小鼠随机分为六组:对照组和5个时间点组(ICH后3h组、ICH后6h组、ICH后12h组、ICH后24h组、ICH后72h组),每组7只CD1小鼠(n=7)。应用自体动脉血诱导的脑出血模型(blood ICH,b ICH),通过western blot的方法,检测PDGFR-β和PDGF-BB的表达变化情况,通过免疫荧光染色的方法测定小鼠脑出血后PDGFR-β的表达水平和细胞定位情况。结果:Western blot的结果提示小鼠脑出血24小时后同侧大脑半球PDGF-BB的表达水平显著高于对侧大脑半球(p<0.05);PDGFR-β的表达从小鼠脑出血后6小时开始升高(p<0.05),并且直到脑出血后24小时都维持在升高的水平(p<0.05)。免疫荧光染色结果提示在小鼠脑出血后24小时的血肿周围,可以检测到PDGFR-β与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)标记蛋白(α-平滑肌肌动蛋白,α-smooth muscle actin,α-SMA)的共表达。结论:小鼠脑出血后PDGFR-β和PDGF-BB的表达增多,并且在血肿周围的血管平滑肌细胞中检测到PDGFR-β的表达。提示PDGFR-β可能参与小鼠脑出血后的脑损伤(brain injury)的过程以及血管平滑肌细胞(VSMC)表型转换(phenotypic transformation)过程。第二部分抑制血小板源性生长因子受体-β改善小鼠脑出血后的脑损伤目的:应用小鼠自体动脉血诱导的脑出血模型,通过小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)技术和PDGFR-β抑制剂(Gleevec)抑制PDGFR-β表达,探讨抑制PDGFR-β是否能够改善小鼠脑出血后的脑损伤情况。方法:将108只8周大小、重量约30克的雄性CD1小鼠随机分为对照组(n=24),ICH组(n=26),ICH+scramble si RNA组(n=26),ICH+PDGFR-βsi RNA组(n=26),ICH+Gleevec组(n=6)。应用小鼠自体动脉血诱导的脑出血模型,在ICH前24小时脑室注射scramble si RNA和PDGFR-βsi RNA,在ICH后1小时腹腔注射PDGFR-β抑制剂(Gleevec)。ICH24和48小时后测定小鼠神经行为学评分情况;ICH24和48小时后处死小鼠,取同侧及对侧大脑半球做标本,测定脑水肿变化情况;ICH24小时后处死小鼠,取脑组织做标本,通过western blot方法和免疫荧光染色的方法测定炎症反应情况和脑血管平滑肌细胞表型转换情况。探讨抑制PDGFR-β是否能够改善小鼠脑出血后的脑损伤情况。结果:与对照组相比,小鼠ICH后24小时和48小时神经行为学评分明显降低(p<0.05),而ICH+PDGFR-βsi RNA组相对ICH组行为学评分明显提高(p<0.05),ICH+scramble si RNA组则无明显变化。与对照组相比,ICH后24小时和48小时后小鼠同侧基底节脑水肿明显增加(p<0.05),而ICH+PDGFR-βsi RNA组相对ICH组脑水肿显著降低(p<0.05),ICH+scramble si RNA组则无明显变化。小鼠ICH后24小时,同侧大脑半球非平滑肌肌球蛋白2B(smooth non-muscle myosin IIB,SMemb)、细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)表达明显增加(p<0.05),而ICH+PDGFR-βsi RNA组相对于ICH组明显降低(p<0.05),ICH+scramble si RNA组则无明显变化。另外,ICH+Gleevec组小鼠脑组织的SMemb、ICAM-1表达相对于ICH组也显著降低(p<0.05)。免疫荧光染色结果表明,在小鼠脑出血后24小时的血肿周围,可以检测到SMemb和ICAM-1与血管平滑肌细胞标记蛋白(α-SMA)的共表达,并且,ICH组和ICH+scramble si RNA组MPO阳性细胞较对照组增多(p<0.05),ICH+PDGFR-βsi RNA组MPO阳性细胞则较ICH组和ICH+scramble si RNA组减少。结论:抑制PDGFR-β能够降低ICH引起的小鼠神经行为学评分降低和脑水肿增加,并且能够减轻ICH后的炎症反应和血管平滑肌细胞表型转换过程。提示抑制PDGFR-β能够改善小鼠脑出血后的脑损伤情况。第三部分血小板源性生长因子受体-β调控脑出血后脑血管平滑肌细胞表型转换及炎症反应的分子机制目的:应用小鼠自体动脉血诱导的脑出血模型,通过si RNA技术和PDGFR-β抑制剂(Gleevec)抑制PDGFR-β表达,通过重组PDGF-BB和丝裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2,MAPKAPK2,MK2)抑制剂(KKKALNRQLGVAA)等干预,检测信号通路相关分子的表达情况,探讨PDGFR-β是否通过p38-MK2信号通路引起血管平滑肌细胞表型转换和加重炎症反应。方法:对照组(n=7),ICH组(n=7),ICH+scramble si RNA组(n=7),ICH+PDGFR-βsi RNA组(n=7)小鼠利用第二部分实验所产生的标本用于分子检测。另将12只8周大小、重量约30克的雄性CD1小鼠随机分为PDGF-BB组(n=6),PDGF-BB+MK2抑制剂组(n=6)。应用小鼠使用立体定向仪向小鼠右侧基底节区注射重组PDGF-BB(200 ng/2ul PBS)和MK2抑制剂KKKALNRQLGVAA(2ug/kg),通过western blot方法和免疫荧光染色的方法检测信号通路相关分子的表达情况,探讨PDGFR-β是否通过p38-MK2信号通路引起血管平滑肌细胞表型转换和加重炎症反应。结果:Western blot检测结果表明,小鼠脑出血后24小时与对照组相比,血肿同侧大脑半球的p-PDGFR-β、p-P38和p-MK2的表达明显增高(P<0.05),ICH+scramble si RNA组的p-PDGFR-β、p-P38和p-MK2的表达相比较于对照组也有明显增高(P<0.05),ICH+PDGFR-βsi RNA组则相对于ICH组和ICH+scramble si RNA组明显降低(P<0.05)。PDGF-BB组小鼠与对照组相比,ICAM-1表达明显增高(P<0.05),PDGF-BB+MK2抑制剂组小鼠与PDGF-BB组相比,ICAM-1表达明显降低(P<0.05)。免疫荧光染色结果表明,在小鼠脑出血后24小时的血肿周围,可以检测到p-p38和p-MK2与血管平滑肌细胞标记蛋白(α-SMA)的共表达。结论:小鼠ICH后,PDGFR-β通过与PDGF-BB结合,激活p38-MK2信号通路引起血管平滑肌细胞表型转换和加重炎症反应。