大众淡水鱼中霍乱弧菌的毒性,抗性和遗传多样性及其可视化检测方法的研究

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:robben11
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霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是人类烈性传染性疾病“霍乱”的致病菌。该菌广泛存在于近岸海域、河口、养殖水域等环境。持续监测水产品中霍乱弧菌污染,对于保障食品安全具有重要意义。然而,涉及淡水鱼中霍乱弧菌的污染情况,国内外的研究报道较少。首先,本研究以我国大众淡水鱼为研究对象,即鲫鱼(Carassius auratus)、花鲢(Aristichthys nobilis)、鳊鱼(Parabramis pekinensis)和草鱼(Ctenopharyngodon idellus),分析了2017年8月从上海市最大的水产品市场采集样品中霍乱弧菌的污染情况,其中,花鲢和鳊鱼中的霍乱弧菌是本文首次研究报道。我们分离、鉴定、随机挑取了400株霍乱弧菌(每种鱼各100株),测定了其毒力、抗菌素和重金属抗性,以及遗传多样性。研究结果显示:400株受试菌株均不含有霍乱毒素(cholera toxin,CT)、毒力共协调菌毛(toxin-coregulated pilus,TCP)、小带联结毒素(zona occludens toxin,ZOT)和辅助霍乱肠毒素(accessory cholera enterotoxin,ACE)的编码基因ctxAB、tcpA、zot和ace;IV型菌毛(putative type IV pilus)、甘露糖敏感血凝素菌毛(mannose-sensitive hemagglutination pili)的编码基因的检出率也极低(pilA:0.8%;mshA:0.8%);然而,RTX(repeat in toxin,RTX)、El Tor溶血素(hemolysin,HlyA)、不耐热溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)和血凝素蛋白酶(haemagglutinin protease)的编码基因rtxA-D(83.0%97.0%)、hlyA(87.8%)、tlh(76.0%)、hapA(95.0%)的检出率较高。受试的400株霍乱弧菌对六大类十种抗菌素的耐药性存在显著差异,其中链霉素的耐药率最高(65.3%),其次为氨苄西林(44.5%)和利福平(24.0%);卡那霉素、利福平和四环素的中介耐药率分别为72.3%、39.5%和34.3%;庆大霉素、氯霉素和壮观霉素的敏感率分别为98.3%、98.0%和95.0%;30.5%的受试菌株检测为多重耐药(Multidrug resistant,MDR)表型,且具有42种不同的抗菌素抗性谱;来源于四种鱼类的霍乱弧菌的多重耐药指数(multiple antimicrobial resistance index,MARI)具有显著差异(p=0.001)。本文还首次测定了四大淡水鱼中霍乱弧菌的重金属耐受性。研究结果显示,约49.3%、30.3%和12.0%的受试菌株分别对重金属汞(Hg2+)、锌(Zn2+)和铅(Pb2+)具有高度耐受性。此外,运用ERIC-PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction)技术,分析并获得了受试菌株的DNA指纹图谱,发现400株霍乱弧菌分为328个ERIC基因型,表明大众淡水鱼中霍乱弧菌具有高度的遗传多样性。其次,基于环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术,本研究建立、优化并评价了霍乱弧菌毒力相关基因(hapA、hlyA、mshA、pilA、rtxA和tlh基因)的快速、灵敏、特异、经济、可视化的检测方法。其中,hapA、mshA、pilA和tlh基因的LAMP检测是本文首次研究报道。针对上述六个毒力相关基因,我们分别设计了3对引物,即内引物(inner primers)、外引物(outer primers)和环引物(loop primers)。研究结果显示,最适LAMP反应体系包含1.6μmol/L内引物(FIP和BIP),0.05μmol/L外引物(F3和B3),0.2μmol/L环引物(LF和LB),6mmol/L Mg2+,1.0 mmol/L dNTP(deoxynucleotide triphosphates),8 U Bst DNA聚合酶,以及2μL DNA模板。反应温度为恒温65°C,反应时间为50 min。LAMP反应结果通过肉眼在可见光或紫外光(302 nm)下判读。以钙黄绿素为显色剂,阳性结果呈绿色,阴性结果为橙黄色。针对霍乱弧菌纯培养物,hapA、hlyA、mshA、pilA、rtxA和tlh基因的LAMP检测灵敏度分别为0.93、14.38、10.92×102、12.77×102、14.38×102和14.38 CFU/mL(菌落形成单位,colony-forming units),其灵敏度是普通PCR方法的10105倍;针对霍乱弧菌基因组DNA,上述基因的LAMP检测灵敏度分别为0.17 fg/μL、14.77 fg/μL、14.07 fg/μL、13.13 fg/μL、1.48 pg/μL和0.15pg/μL,其灵敏度是PCR方法的10104倍;针对人工污染鱼肉样品,上述基因的LAMP检测灵敏度分别为7.54、7.54×102、9.77×103、4.85×103、7.54×105、7.54×103CFU/mL,其灵敏度是PCR方法的10104倍。综上所述,本文研究结果不仅为我国水产食品安全风险评估提供了有用的数据,而且为水产品中霍乱弧菌的快速、可视化检测提供了技术支撑。
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