【摘 要】
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该文应用SMART cDNA Library Construction kit的方法,以玫瑰红绿海葵触手为研究材料,构建以真核表达载体pcDNA3为基础的cDNA表达文库.对文库克隆进行序列测定和生物信息学分
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该文应用SMART cDNA Library Construction kit的方法,以玫瑰红绿海葵触手为研究材料,构建以真核表达载体pcDNA3为基础的cDNA表达文库.对文库克隆进行序列测定和生物信息学分析,已经获得了73个海葵新表达序列标签(ESTs),有24个全长cDNA,其中包括海葵细胞毒素、海葵神经毒素、绿色荧光蛋白等具有开发应用价值的新基因.根据文库的EST序列设计引物,从玫瑰红绿海葵克隆到一全长cDNA序列,命名为Src I,利用生物信息学方法对其进行了分析. 该文利用基因工程手段,将Src I基因进行原核重组表达,然后分离重组蛋白,研究重组蛋白Src I的性质、功能和可能的作用机制.首先构建了Src I基因的非融合蛋白表达质粒pBV220-Src I,并成功地在原核细胞E.coli进行了重组表达,筛选出稳定表达的工程菌株DH5α,摸索了稳定表达的条件,摸索了包涵体的洗涤、变性和复性条件,摸索出了复性蛋白Src I的纯化工艺,纯化过程简单,经QSepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose疏水层析两步纯化,就可获得了高纯度的重组蛋白样品(纯度达99﹪以上),该纯化方法适合重组蛋白的大量纯化,为Src I的性质、结构和功能研究奠定了良好的基础.在获得重组蛋白Src I的基础上,对其性质、生理活性和作用机理进行了研究.
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