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研究背景及意义巨噬细胞广泛分布于全身各个组织和器官，在保持内环境稳定、机体防御、炎症调控、促进损伤修复等方面起着重要作用。巨噬细胞虽被认为是终末分化细胞，但研究表明其有一定的自我增殖能力和分化潜能，巨噬细胞在体内炎症刺激下可转化为淋巴内皮样细胞，而在体外可转化为血管内皮细胞、平滑肌细胞和成肌纤维细胞。另外，巨噬细胞在不同微环境下可激活分化为不同的功能表型，且在合适条件下还可发生重分化，具有较强的可塑性。巨噬细胞在不同微环境下呈现不同功能表型的特点，使其在机体不同生理、病理条件下能够发挥不同的功能，与肿瘤、代谢综合症等多种疾病的发生、发展密切相关。静息巨噬细胞在不同微环境下可激活分化为表型和功能迥异的两大类型：炎症型巨噬细胞和抗炎型巨噬细胞，又称M1巨噬细胞和M2巨噬细胞。M1巨噬细胞由γ-IFN或γ-IFN和LPS等诱导，诱发Th1型免疫应答，起着防御细菌感染、加重炎症反应导致组织损伤的作用。M2巨噬细胞由IL-4或IL-4和IL-13等诱导，虽然由于激活条件的不同，还可以细分为M2a、M2b、M2c三种亚群，主要诱导Th2型免疫反应，防御寄生虫感染，促进组织修复和减轻或调控炎症免疫应答。研究发现，M1和M2巨噬细胞在一定微环境下可分别重分化为M2样和M1样巨噬细胞，具有较大的可塑性。在动脉粥样硬化和Ⅱ型糖尿病动物模型中，M2巨噬细胞可原位向M1样表型转化。而在肿瘤动物模型中，则观察到在外源性IL-12的作用下，M2样表型的肿瘤细胞可转变为M1样表型，同时体外实验也证实，M1和M2巨噬细胞在分别适合M2和M1分化的条件下孵育时，细胞呈现出M2样和M1样巨噬细胞的特性。功能分化巨噬细胞的重分化与多种疾病的发生和发展密切相关，在Ⅱ型糖尿病的发生中，正常机体脂肪组织巨噬细胞为分泌精氨酸酶-1的M2样表型，但是随着机体肥胖程度的增加，脂肪组织巨噬细胞由M2型向M1样表型转化，可分泌TNF-α、IL-6、iNOS等炎症因子等，干扰脂肪细胞胰岛素的正常信号通路，导致胰岛素抵抗而诱导Ⅱ型糖尿病。类似的，在动脉粥样硬化症中，病变部位巨噬细胞由M2型向M1样特性转变，也与病情的进展密切相关。而在肿瘤的发生和进展中，受肿瘤微环境的影响，肿瘤相关巨噬细胞由具有肿瘤杀伤活性的M1样表型向M2样表型转化，可抑制机体免疫反应，促进肿瘤新生血管生成和肿瘤基质的重塑，最终促进肿瘤的生长和转移。因此，对巨噬细胞功能极化可塑性机制的研究具有重要的意义，同时，对该过程机制的研究可以深化我们对细胞尤其是免疫细胞适应不同微环境机理机制的认识，为多种疾病的治疗提供重要的理论依据。研究方法1、体外诱导培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞，并运用流式细胞仪检测小鼠骨髓来源巨噬细胞的纯度。2、脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)分别诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞向M1巨噬细胞、M2巨噬细胞极化，采用Real time PCR技术检测小鼠RAW264.7巨噬细胞在不同功能状态(M1和M2)下，特定标记基因TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1、MCP-1、MRmRNA的表达，及调控巨噬细胞极化的转录因子CEBPδ、PPARγ、IRF4、IRF5mRNA的表达。3、体外培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞，运用脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)在优化条件下分别将原代骨髓来源巨噬细胞诱导极化为M1巨噬细胞和M2巨噬细胞。采用Real time PCR技术检测原代骨髓来源巨噬细胞中TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1、IL-1β、iNOS、MR及转录因子CEBPδ、PPARγ、IRF4mRNA水平的表达。4、采用CCK-8试剂盒检测不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin(TSA)和DNA去甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞(Aza)对小鼠骨髓来源巨噬细胞增殖能力的影响。脂多糖(LPS)诱导原代巨噬细胞向M1巨噬细胞极化，在极化过程中分别加入Trichostatin(TSA)、5-氮杂-2-脱氧胞(Aza)。白介素-4(IL-4)诱导原代巨噬细胞向M2巨噬细胞极化，在此过程中分别加入Trichostatin(TSA)、5-氮杂-2-脱氧胞(Aza)。采用Real time PCR技术检测巨噬细胞中TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1mRNA水平的表达变化。实验结果1、本研究中，不断改进骨髓来源巨噬细胞的体外培养方法。小鼠骨髓来源巨噬细胞的FITC-F4/80阳性率达到了98.6％，APC-CD11b阳性率达到了98.2％，双阳性率为98.1％，即巨噬细胞的纯度为98.1％。2、脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)在不同时间条件下诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞向M1、M2巨噬细胞极化。LPS体外刺激巨噬细胞8h，M1巨噬细胞特定标记基因TNF-α、IL-6mRNA水平的表达最高，巨噬细胞表现最显著的M1功能表型。IL-4体外刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞24h，M2巨噬细胞特定标记基因Arginase、Fizz-1mRNA水平的表达最高，此时巨噬细胞表现最强的M2功能表型。3、小鼠骨髓来源巨噬细胞在优化条件下分别极化为M1、M2巨噬细胞，表现出显著的M1、M2功能表型。当体外刺激条件改变时，M1、M2巨噬细胞均可发生重分化。M1细胞重分化为M2样巨噬细胞，M2细胞重分化为M1样巨噬细胞，TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1、IL-1β、MR mRNA的表达也发生相应改变。4、50nmol/L的Trichostatin(TSA)、1μmol/L的5-氮杂-2-脱氧胞(Aza)对原代骨髓来源巨噬细胞增殖的抑制率最小。在M1巨噬细胞极化过程中分别加入50nmol/L的Trichostatin(TSA)、1μmol/L的5-氮杂-2-脱氧胞(Aza)。同时，在M2巨噬细胞极化过程中也分别加入50nmol/L的Trichostatin(TSA)、1μmol/L的5-氮杂-2-脱氧胞(Aza)。结果显示：M1、M2巨噬细胞中特定标记基因TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1mRNA的表达明显增加。实验结论1、脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)在不同时间条件下刺激巨噬细胞，使巨噬细胞获得不同的功能表型。LPS体外刺激巨噬细胞8h，使巨噬细胞获得最显著的M1表型，而IL-4体外刺激巨噬细胞24h则使巨噬细胞获得最显著的M2表型，巨噬细胞的极化是一个连续的过程，M1、M2只是极化过程的两个极端。2、功能极化的巨噬细胞(M1、M2)在体外微环境发生改变时均可发生重分化，具有较强的可塑性。3、Trichostatin(TSA)、5-氮杂-2-脱氧胞(Aza)增强了巨噬细胞中M1/M2特定标记基因TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1的表达，组蛋白乙酰化、DNA甲基化可能参与了巨噬细胞的极化。