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microRNA(miRNA)作为一类非编码小RNA,通过互补配对识别mRNA,降解mRNA或阻遏其翻译进程,在基因的转录后调控中发挥着重要的功能。miRNA参与调节众多生理过程,包括细胞生长、组织分化等。临床及基础研究均显示,多种疾病的病理进程往往伴随着许多miRNA表达水平的异常。因此对于miRNA与调控基因的研究既有利于了解正常的生理机制,也有助于了解疾病发生或病理特征产生的原因、寻找治疗疾病或缓解病理进程的方法,以及探索作为辅助疾病早期诊断的生物学指标。本课题中我们以痴呆动物模型——Presenilin 1/2条件性双敲除(DKO)小鼠为研究对象,通过miRNA芯片检测DKO小鼠大脑中异常表达的miRNAs,寻找受异常表达miRNA调控的靶基因,并进一步对miRNA对靶基因的调控所影响的生理功能进行探究。本课题利用荧光定量PCR、Western Blot等分子生物学手段分析DKO小鼠前额叶中表达异常上升的miR-125b及可能受miR-125b调控的靶基因,随后在N2a及PC12两种细胞系中证明miR-125b对神经细胞黏附分子(NCAM)的抑制作用,并且影响NCAM参与的分化进程。通过进一步观察,我们发现miR-125b对NCAM的调控能够提高糖原合成激酶3β(GSK3β)的活性,并影响tau蛋白磷酸化水平。实验结论如下:1.Presenilin1/2条件性敲除小鼠前额叶miRNA芯片分析通过对miRNA芯片数据分析,并对芯片结果中表现出在DKO大脑皮层中升高或降低的miRNA进行验证,荧光定量PCR结果显示miR-125b在12月龄DKO小鼠前额叶中的表达明显高于同年龄对照小鼠;通过对不同月龄小鼠前额叶miR-125b的表达情况进行检测,发现DKO小鼠相比于对照小鼠前额叶中miR-125b表达随着年龄的增长逐渐升高。2.miR-125b调控NCAM蛋白的表达与功能我们首先利用生物信息学方法对miR-125b可能调控的基因进行预测,并在DKO小鼠中对预测结果中的BDNF、ASIC1a和NCAM的mRNA进行检测。结果显示:12月龄DKO小鼠中NCAM mRNA水平显著下降,并且下降水平相较于6月龄小鼠更为显著。通过双荧光素报告基因检测系统,我们在N2a细胞系中验证了miR-125b对NCAM 3’-UTR存在调控作用;通过建立稳定表达外源miR-125b的PC12细胞株,我们进一步观察到miR-125b能够降低NCAM蛋白的表达,这与我们在12月龄DKO小鼠前额叶皮层中检测所得数据相吻合。此外,我们在PC12细胞系中观察到miR-125b的表达升高抑制NCAM参与的神经突增生进程,神经突的长度与延展均受到抑制;在小鼠前额叶中过表达miR-125b抑制NCAM,能够引起神经元树突棘密度的降低。3.miR-125b调控NCAM蛋白水平影响GSK3β活性与Tau蛋白磷酸化作为磷酸化tau蛋白的重要激酶,GSK3β的磷酸化位点受多种上游蛋白调控,已有研究表明上调NCAM的表达可抑制GSK3β的活性,但下调NCAM对GSK3β活性的影响目前少有研究。我们证明在PC12细胞的分化阶段,利用miR-125b阻遏NCAM的表达会减弱对GSK3β活性的抑制作用,影响细胞的分化,并且引起tau蛋白的磷酸化水平上升;在表达外源miR-125b的PC12细胞的凋亡过程中,我们也观察到GSK3β的整体活性显著高于对照组,并且凋亡因子caspase-3活性上升,tau蛋白的磷酸化水平也表现出升高。进一步,在体水平实验显示,在小鼠前额叶皮层上调miR-125b引起GSK3β活性升高,tau蛋白磷酸化水平也显著上升。综上所述,miR-125b不仅能够直接调控NCAM的表达,并影响细胞分化中突触结构的稳定,还可通过降低NCAM对GSK3β的抑制作用使GSK3β的活性升高,以及促进其对tau蛋白的磷酸化作用;且这一分子通路可能参与了DKO小鼠痴呆发生的进程。本课题的实验结果或可为研究痴呆病理进程中如神经纤维缠结及神经元凋亡等的机制提供帮助。