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家蚕细小病毒样病毒(Bombyx mori parvo-like virus,BmPLV)是动物病毒中的首例二分DNA病毒,能够使家蚕罹患严重的浓核症。该病毒粒子直径为22～24nm,无囊膜包裹,呈球型。其特点是基因组为单链线性、双分子DNA(VD1、VD2),且两条单链分别独立包装在不同的衣壳中,DNA末端的反向重复序列中无发夹结构。它的另一显著特征是基因组的VD1-ORF4编码DNA聚合酶,命名为pol基因。这些特征预示该病毒的复制机制完全不同于细小病毒。开启VD1-ORF4功能特性研究,是探索该病毒复制机制的关键。
VD1-ORF4含有3318个碱基,编码分子量为128KDa,1105个氨基酸的多肽,命名为P128。该蛋白的N端(1～326位氨基酸)功能未知,C端包含DNA聚合酶B家族2特征氨基酸序列,该家族是以蛋白为引发的DNA聚合酶。Pol基因中327～612位的氨基酸含有在原核和真核生物DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性结构域的保守基序ExoⅠ(DxE)、ExoⅡ(Nx3F/YD)和ExoⅢ(Yx3D);699～1002位的氨基酸含有DNA聚合酶聚合结构域的保守基序:Dx2SLYP(Ⅰ)、Kx3NSxYG(Ⅱ)、Tx2G/AR(Ⅲ)、YxDTDS(Ⅳ)和KxY(Ⅴ)。
本论文主要对家蚕细小病毒样病毒VD1-ORF4基因主要结构域进行了以下三个部分的研究:(1)克隆和表达VD1-ORF4的N端326个氨基酸的多肽,并制备多克隆抗体,以该抗体检测病毒粒子中的蛋白;(2)克隆和表达VD1-ORF4的polmotif,并制备多克隆抗体,以该抗体检测分析在感病的宿主体内P128蛋白的表达时相;(3)在杆状病毒Multibac系统表达P128蛋白,以期提高其表达量,获得具有生物活性的蛋白。
1、ORF4的N端和ORF4聚合结构域的克隆及原核表达
以pET-30a(+)作为原核表达载体,用IPTG诱导,在E.coliBL21中进行病毒基因VD1-ORF4N端(ORF4-N)和聚合结构域(POL)的原核表达。表达的ORF4-N蛋白和POL蛋白的大小与预测的相一致。利用His抗体对原核表达融合蛋白进行westernblot分析,结果显示表达的蛋白为与His融合的目的蛋白。
2、ORF4的N端和ORF4聚合结构域抗体的制备
利用Ni-NTA柱纯化重组蛋白His-ORF4-N和His-POL,将纯化到的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗血清anti-ORF4-N和anti-POL。用ELISA技术检测抗体的效价为1:6500,高于1:2000,可以用于后续实验。经ProteinA亲和凝胶柱获得纯化的抗血清。SDS-PAGE电泳分析结果显示只有抗体的重轻两条链,纯化效果良好。
3、DNA聚合酶表达时相分析
对5龄家蚕经口添食病毒(BmPLV),在添食病毒后的不同时间点取家蚕的中肠。样品经组织裂解液处理后,以anti-POL为一抗,以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体为二抗,经westernblot检测P128在家蚕中肠的表达情况。结果显示,在添食病毒后的家蚕中肠组织中,DNA聚合酶蛋白的表达动态与该基因的转录以及病毒基因组DNA的复制动态相一致。
4、ORF4的N端蛋白在病毒粒子中的鉴定
从感染BmPLV的病蚕蚕沙中纯化病毒粒子,加热使病毒粒子蛋白解聚,经SDS-PAGE分离,以anti-ORF4-N,anti-P128和anti-POL分别对其进行westernblot分析,结果显示,以anti-ORF4-N检测病毒粒子蛋白,能够观察到两条信号强的蛋白带,表明ORF4的N端编码的蛋白可能参与病毒粒子组成。
5、ORF4在杆状病毒MultiBac系统中的表达
将病毒基因VD1-ORF4克隆到杆状病毒穿梭载体pFBDM的多克隆位点中,构建pFBDM-ORF4重组转移载体。转化至受体菌DH10MultiBac获得重组的Multibacmid-ORF4。重组的Multibacmid-ORF4转染昆虫细胞Hi5得到重组病毒rMultibac-ORF4。用rMultibac-ORF4复感昆虫细胞表达P128蛋白,以anti-POL对表达产物进行westernblot鉴定。结果显示表达的蛋白大小约为46KDa。表达的蛋白可能在样品的制备或细胞中被蛋白酶切割以致降解。