帕金森病(Parkinson’s Disease PD)是一种好发于中老年、以锥体外系黑质(Substantia nigra, SN)多巴胺(Dopamine, DA)能神经元进行性变性、坏死为主要病理表现,是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)最常见的中枢神经系统退行性疾病,也是发病率第一位的运动神经系统退行性疾病。PD的发病机制尚不清楚,目前认为是环境以及遗传等多种因素所共同作用的结果。对于PD患者而言,当DA的含量减少至生理水平的70%以上时,就会出现临床症状,并以进行性加重的运动迟缓、肌强直、静止性震颤以及植物神经紊乱等为主要特征,并可能伴有心理以及精神症状改变。统计资料表明,PD总发病率为0.1%-0.2%,其中55岁以上人群发病率为1.4%,而75岁以上人群这一比率上升至3.4%；数据表明,随着年龄的增长,PD的发病率呈逐渐上升趋势。随着我国乃至世界人口老龄化速度的加快,PD患者的患病人数也在日趋增加,病人因此而饱受痛苦,同时也给社会及家庭带来巨大的负担。目前,PD的治疗手段主要有：内科治疗、外科治疗,以及细胞移植治疗等方法。内科治疗以口服DA制剂,DA受体激动剂,DA增强剂,抗胆碱类药物、单胺氧化酶(MAO-B)抑制剂及儿茶酚胺邻甲基转移酶(COMT)抑制剂等药物为主,虽然服用早期对于PD患者疗效确切,能够起到缓解症状的作用,但是都不能延缓PD的自然病程进展,同时随着口服药物时间的延长,疾病的进展,单次药物的剂量需要不断加大,服用药物的间隔时间不断缩短,并出现药物耐受现象以及“异动”症状等副作用,同时,长期服用DA类药物还可以加重对中脑内残余DA神经元的损伤,而加重病情；外科治疗对于中晚期PD患者的近期疗效具有较好的效果,目前常用的手术方式包括：立体定向下核团毁损术以及丘脑底核(STN)深部脑刺激电极埋植术(DBS)等。核团毁损手术是一种破坏性手术,对于双侧症状明显患者,通常为避免更严重的并发症而以一侧手术为主,由于可能存在毁损灶的自我修复作用,其远期疗效受到限制；而DBS手术疗效确切,并有逐渐取代核团毁损术的趋势,但是,DBS高昂的价格又限制其能够得到广泛的应用,同时,术后仍不能改变PD的自然进程。因此,无论是内科治疗还是外科治疗,都只是缓解症状的手段,属于对症治疗,并不能阻止和逆转PD患者SN区DA能神经元进行性减少的病理进程。随着基因工程技术以及干细胞理论和实验研究的不断深入,为PD的治疗提供了一个全新的理念及可能。目前认为,PD是最适合于给予细胞移植及基因治疗的疾病之一,因此,细胞移植及基因治疗为PD的真正治愈提供了广阔的空间。基质细胞衍生因子-1α(stromal cell derived factor-1, SDF-1α)是一类新近发现的α(CXC)趋化因子家族成员。SDF-1α在神经系统发育以及脑损伤中具有重要的调节和趋化作用。研究发现,SDF-1α大量及选择性地在发育的中枢神经系统中表达,并随着发育过程,表达量呈进行性降低。而其唯一配体CXCR4对于中枢神经系统的发育是非常重要的,CXCR4能使得神经元顺其梯度改变发生迁移。另有研究也证实,CXCR4受体或SDF-1α基因敲除的小鼠出生后表现出器官发育上的缺陷：包括神经系统发育障碍,并于出生前后死亡；而且SDF-1α及其受体CXCR4在小脑、海马和大脑新皮质的发育中发挥重要的作用。对于这一作用,普遍认为SDF-1α在低浓度时刺激神经元轴突延伸,而在高浓度时抑制神经元轴突形成,在部分轴突观察到SDF-1α可以促进轴突分支,这种作用可能与CXCR4在神经元的表达部位有关。在神经元祖细胞,CXCR4大量表达在胞体和轴突前沿,随着细胞分化成熟,CXCR4主要沿着轴突和树突表达,很少在胞体表达。另外,相关研究称,表达CXCR4的骨髓干细胞能够沿着SDF-1α的浓度梯度而定向迁移；在组织及器官损伤的情况下,SDF-1α能促进骨髓干细胞、炎症细胞募集到损伤部位,它既是调节组织、器官损伤修复的关键细胞因子,也是一个调节局部炎症的重要趋化因子。同时也有研究发现,血管内皮生长因子(VEGF)能促进血管内皮细胞SDF-1α的表达,同时通过阻断SDF-1α/CXCR4轴可以起到抑制VEGF依赖的血管形成作用；而且高表达CXCR的肿瘤细胞有更高的转移潜能,伴自分泌SDF-1α的肿瘤细胞株转移潜能更高。因此,SDF-1α的生物学特性也决定了它可能在组织、器官损伤的修复过程中发挥着“诱导”或“召唤”内源或者外源干细胞迁移等重要作用。在PD的细胞移植研究中,种子细胞的选择一直是研究的热点。胎源干细胞(Gestation-derived stem cells, GdSCs)是一群来源于胚胎、胎儿以及胎儿附属器官的干细胞,包括胚胎源性干细胞(Embryo-derived stem cells, EdSCs)、胎儿源性干细胞(Fetal-derived stem cells, FdSCs)以及胎儿附属器官源性干细胞(Fetal appendage-derived stem cells, FAdSCs),其中FAdSCs包括脐血间充质干细胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells, UCBMSCs)、脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs)以及胎盘间充质干细胞(placenta mesenchymal stem cells, PMSCs)等。胚胎以及胎儿自身发育成熟的过程,其实就是大量各个阶段的干细胞(全能干细胞、多能干细胞以及成体干细胞等)不断流动更新以及增值分化的过程,在这一过程中,每个细胞、组织乃至器官都存在巨大的发育潜能以及强大的可塑性。此前的研究已经证实,EdSCs在体外环境下能够像DA能神经元分化；近期也有研究显示,在神经元条件培养基、音猬蛋白(sonhedgehog, SHH)(?)(?)成纤维细胞生长因子-8 (Fibroblast growth factor 8, FGF-8)共同作用下,UCMSCs能够被成功诱导为表达酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)、并能够分泌DA的DA能神经元。然而,在成体干细胞(Adult stem cells, ASCs)的研究中,即使ASCs具有横向诱导分化能力已经被普遍承认,但是,将其定向诱导分化分为特定神经元或DA能神经元依然是研究中的“瓶颈”；虽然在2006年,日本科学家Takahashi和Yamanaka将4种转录因子(Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc)在体外同时转导小鼠的皮肤成纤维体细胞,使之成为具有像EdSCs一样有多发育潜能的诱导多能干细胞(induced pluripoten tstem cells, iPS),但是iPS的研究依然存在着定向分化不稳定以及较强的致瘤性重要缺陷。因此,在PD的干细胞移植以及基因的目前治疗中,仍以中脑来源的FdSCs移植疗效最为肯定。但是,这种治疗方法受到移植时机选择以及伦理问题、胎源细胞来源少等限制,难以得到广泛应用。因此,如果能够能够利用胎儿发育过程中巨大的种子细胞来源,通过某种“自然召唤”的诱导方式使GdSCs达到特定损伤部位,在其微环境的诱导下向特定细胞分化,最终起到修复、治疗的目的,而又不损伤胎儿,则可能根本解决供体来源以及伦理等问题。因此,本研究的目的旨于观察胎源细胞在PD动物模型体内的迁移,评价其对PD模型的治疗作用,同时,探讨胎源细胞在体内的迁移机制,以及为进一步可迁移胎源细胞生物学特性的鉴定以及筛选提供前提条件,为胎源细胞以及SDF-1α的临床应用提供实验依据。因此,本研究共分为三个部分：第一部分帕金森病MPTP小鼠的建立及评价本部分研究中,采用小剂量间隔多次的方法,共计16天分6次皮下注射MPTP成功制作了C57BL/6j小鼠PD模型。在每次注射MPTP药物后以及制模后每日上午9时连续1小时观察小鼠行为变化情况及持续时间；并在制模开始后第0、4、7、13、16天局部注射MPTP后30分钟,给予行爬杆实验,并记录所用时间爬杆实验检测小鼠协调运动能力；分别于制模开始后第16天局部注射MPTP后,以及制模后第30天,采用免疫组化方法统计并比较各组小鼠中脑黑质TH+神经元数量的改变；分别于制模开始后第10、16天局部注射MPTP后,以及制模后第30天,应用高效液相色谱-荧光检测器检测各组小鼠黑质DA含量的变化,并综合评价小鼠PD模型。结果提示,MPTP组小鼠注射药物后在行为学上出现了肢体震颤、弓背、竖尾、竖毛、后肢张开、运动迟缓、步态不稳等改变,较好地模拟PD的症状；同时在爬杆实验上,MPTP组小鼠爬杆时间呈逐渐延长趋势(F=39.532,P<0.001),同时较对照组延长(F=234.896,P<0.001),其中制模后第16天所用爬杆时间(19.36±1.68)秒较对照组(12.31±7.52)秒延长约3倍；病理学检查方面,MPTP组小鼠中脑黑质TH+神经元数量较对照组显著减少(F=712.128,P<0.001),同时呈逐渐下降(t=7.387,P<0.001),制模开始后30天(54.40±5.77)个/高倍视野,仍较对照组(313.20±25.13)个/高倍视野减少约82.6%,与PD的病理改变相符；在中脑DA神经递质检测方面,MPTP组小鼠DA含量较对照组显著减少(F=1655.877,P<0.001),并呈进行性下降(F=433.320,P<0.001),制模开始后30天,仍较对照组减少约81.3%,较好的模拟了PD的神经递质改变。以上结果表明,MPTP小剂量、多次皮下注射建立的C57BL/6j小鼠亚急性PD模型成功率高,死亡率低,在行为学、病理以及脑内神经递质改变等方面较好的模拟了PD的变化,是一种较为理想的PD动物模型,为本实验下一步进展提供了前提条件。第二部分小鼠SDF-1α基因真核表达质粒的构建及鉴定在本部分研究中,采用分子生物学技术,在构建SDF-1α目的基因引物后,应用PCR方法,在小鼠cDNA中成功提取了目的基因SDF-1α基因,在限制性性内切酶XhoI及EcoRI酶切以及连接酶作用下,将小鼠SDF-1α基因克隆至载体pDsRed2-N1的多克隆位点上,构建了新的质粒pDsRed2-N1-SDF-1α;经过限制性性内切酶XhoI及EcoRI酶切产物凝胶电泳及测序后,证实在载体质粒pDsRed2-N1的多克隆位点内,XhoI及EcoRI酶之间成功插入了小鼠SDF-1α基因,成功构建了小鼠真核表达质粒pDsRed2-N1 SDF-1α;将质粒pDsRed2-N1-SDF-1α在脂质体LP2000的辅助下转染至人肝癌SMMC7721细胞系,转染后12小时,在荧光显微镜下可见早表达红色荧光；培养24小时后,荧光显微镜下可见荧光表达逐渐增多；流式细胞仪检测转染后人肝癌细胞红色荧光蛋白表达率为：转染后3天(26.48±4.77)%,5天后为(40.00±4.97)%,较第3天转染率显著增高(t=-4.394,P=0.002),同时在转染后第5天,荧光免疫细胞化学SDF-1α-FITC染色后,经流式细胞仪双标细胞计数检测,红、绿荧光蛋白共表达率为(28.40±1.30)%,其中共表达细胞占红色荧光蛋白表达细胞的71.0%；结果表明,质粒pDsRed2-N1-SDF1α能够转染真核细胞,并同时表达指示蛋白RFP及小鼠SDF1a因子,其共表达率为71%。在引入RFP的表达后,使目的因子SDF-1α的表达在观察中更加直观化,为进一步活体实验中目的因子表达的检测以及追踪提供了便利条件。第三部分SDF-1α诱导胎源干细胞在PD鼠模型脑内的迁移本章研究中,将此前构建质粒pDsRed2-1-SDF-lα在立体定向技术下局部注射至PD模型小鼠脑内右侧尾状核头部,并使之与GFP基因工程雄性小鼠交配,并受孕、分娩。通过观察模型小鼠行为学改变、检测SN区DA含量,以及荧光显微镜/共聚焦显微镜下观察GFP细胞的表达,并通过流式细胞仪检测血液中GFP细胞数量,Western blots检测不同组织中SDF-1α的表达来综合评价PD模型小鼠症状的改善。结果表明：两组模型小鼠随着制模时间的延长,部分运动症状均有所改善,但是两组中成功模型小鼠症状改善更为明显,但两组成功PD模型小鼠间症状无明显差异；两组成功模型PD小鼠DA含量(45.32±7.35)ng/g显著高于未成功模型PD小鼠(33.35±3.88)ng/g(F=28.386,P<0.001),而且SDF-1α组提高更为显著(t=3.246,P=0.018),但是,两组未成功PD小鼠间DA含量无显著差异(t=0.041,P=0.969)。两组成功模型PD小鼠血液中均可检测到GFP细胞的表达,但是SDF-1α组GFP细胞的表达量显著高于假手术组(t=18.155,P<0.001),是假手术组的7倍。各组SDF-1α因子表达的检测结果可见,SDF-1α组针道附近脑组织中处于高表达状态,其次为其附近脑组织中,再次为在肝脏及血液的表达,而在假手术组脑组织中未见有明确表达；在GFP观察中可见,SDF-1α组经产小鼠嗅球内出现明显表达GFP的细胞,并且细胞形态已经出不具备了神经元样结构；同时在质粒pDsRed2-N1-SDF-1α移植局部脑组织中,可同时观察到RFP及GFP的表达,同时可以观察到GFP细胞在肝脏及脾脏血管及窦的壁上的表达；但是在假手术组却没有出现上述表现。同时在Y染色体特异表达基因Sry检测中可见,各组及部位之间交互效应显著(F=18.108,P=0.003)即不同分组间Sry基因含量有显著差异,SDF-1α组Sry基因含量显著高于假手术组(F=135.706,P<0.001)；SDF-1α组脑组织中Sry基因含量(16.36±1.98)%。显著高于同组肝脏组织(10.70±1.37)‰(t=4.076,P=0.015)；而在假手术组中,肝脏内Sry基因含量虽然高于同组脑组织,但是两者间无显著统计学差异(t=1.548,P=0.197)。结果表明：SDF-1α通过浓度的梯度改变,诱导了胎源干细胞向PD模型小鼠体内迁移,并PD模型小鼠起到了治疗作用。总之,胎源细胞能够在SDF-1α的诱导下向PD小鼠体内迁移,并能够通过血脑屏障迁移至小鼠脑内,并部分改善了PD小鼠的症状,提高了脑内DA的含量,达到治疗的目的。因此同时,SDF-1α是促使胎源细胞迁移的机制之一,而血液迁移是胎源细胞的主要移植途径。为进一步可迁移胎源细胞生物学特性的鉴定以及筛选提供前提条件,为胎源细胞以及SDF-1α的临床应用提供了实验依据。