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研究背景:脊柱畸形是一种由多种病因引起的严重影响患者日常生活和外观的骨科疾病,其中先天性脊柱侧凸(Congenital Scoliosis,CS)就是一种复杂的脊柱三维畸形,其椎体畸形是由胚胎时期体节发育异常导致的。CS特征性表现为脊柱冠状面向左或向右侧弯曲角度超过10度。严重的CS会导致患者丧失正常劳动能力或终身瘫痪。CS常为出生时或儿童期发现,外观的异常常可影响患儿的身心健康,也给患儿的家庭造成沉重负担。在临床上,CS患者可以仅表现为先天性椎体畸形(Congenital vertebral malformation,CVM);也可以除 CVM 外同时伴发其它系统畸形,如脊髓、心脏、泌尿生殖系、其他骨骼肌肉畸形和消化道系统畸形等,作为一系列综合征的主要临床表现之一。CS的病因尚不明确;目前对CS的临床治疗主要以保守或手术矫形控制侧凸的进展;同时对CS侧凸进展的速度和侧凸角度变化缺乏预测手段。因此,阐明CS的病因对于CS的早期精确诊疗和预测病情进展有重要的临床意义,探索CS的早期诊断方法和有效的病因学干预靶点是当前国际研究热点。近年来,随着基因检测技术尤其是二代测序(Next generation sequencing,NGS)应用和发展,越来越多的CS候选致病基因的发现,遗传因素被认为是导致CS的重要病因。MYH3(Myosinheavy chain 3)编码肌球蛋白重链3蛋白,又称胚胎型肌球蛋白重链(Myosin heavy chain-embryonic,MyHC-emb),在骨骼、肌肉发育过程中表达的一种骨骼肌特异性收缩蛋白。MYH3基因在成人肌细胞及成骨细胞不表达,在骨骼肌损伤后骨骼肌再生时可短暂重新表达。目前研究证实MYH3致病性突变可导致多种先天性骨骼畸形综合征,包括1型先天性远端关节挛缩(Arthrogryposis,distal,type 1;DA1);2A 型先天性远端关节挛缩(Arthrogryposis,distal,type2A;DA2A)、2B3 型先天性远端关节挛缩(Arthrogryposis,distal,type 2B3;DA2B3)、脊柱腕骨跗骨融合综合征(SCTs)、关节挛缩、翼状胬肉和脊柱腕骨跗骨融合综合征 1A(Contractures,Pterygia,and Spondylocarpotarsal Fusion Syndrome 1A,CPSFS1A)和关节挛缩、翼状胬肉和脊柱腕骨跗骨融合综合征1B(Contractures,Pterygia,and Spondylocarpotarsal Fusion Syndrome 1B,CPSFS1B)。MYH3 基因在胚胎期的脊柱和椎旁肌肉特异性转录表达,MYH3基因相关的致病性突变在远端关节挛缩(DA)队列和脊柱腕骨跗骨融合(SCTs)队列得到筛选和鉴定,DA和SCTs疾病中常有先天性椎体畸形的表型,提示MYH3基因突变可能是CS的潜在病因。目前尚未有关于MYH3基因突变在CS队列致病性评估的研究。研究目的:基于北京协和医院DISCO(系统解析脊柱侧凸及相关合并症国际协作组,Deciphering Disorders Involving Scoliosis and Comorbidities,http://www.discostudy.org/)的CS队列研究MYH3基因在CS的致病机制,包括候选突变筛选,体外功能实验和表型-基因型相关性分析。研究方法:根据严格的纳入和排除标准,基于北京协和医院DISCO(系统解析脊柱侧凸及相关合并症国际协作组,Deciphering Disorders Involving Scoliosis and Comorbidities,http://www.discostudy.org/)队列中 447 例 CS 患者进行了全外显子组测序及数据分析,评估、筛选MYH3基因致病性突变并进行Sanger测序验证。体外实验部分通过蛋白质免疫印迹实验和qPCR评估MYH3蛋白表达变化及对TGF-β信号通路关键蛋白磷酸化的影响;利用minigene实验验证MYH3剪切位点突变的致病性。通过基因型-表型关联分析研究MYH3基因突变与CS具体临床表型之间的关联性。研究结果:在本研究纳入的447例CS患者中,通过全外显子测序(WES)及初步分析,我们基于CS核心家系病例筛选出2例显性遗传的MYH3基因de novo错义突变和2例隐性遗传的MYH3基因的复合杂合突变;我们在CS散发病例中筛选出14例致病性相对较高的MYH3基因突变,包括移码突变1例,剪切位点突变1例,错义突变12例。根据ACMG基因突变解读标准和指南,c.841G>A(p.Glu281Lys)、c.1400A>C(p.Glu467Ala)、c.3249-93249-5del/c.1582-6A>G 和 c.3062del/c.4244T>G 4个基于CS核心家系的MYH3基因突变位点判定为可能致病突变(Likely Pathogenic,LP);而14例散发患者的MYH3基因突变判定为致病性不明的突变(VUS)。我们通过体外功能实验,验证MYH3基因的错义突变c.841G>A、c.1400A>C、c.4244T>G不影响MYH3基因编码形成胚胎型肌球蛋白重链(MYH-emb),错义突变型蛋白会下调TGF-β信号通路中关键蛋白的磷酸化过程;c.841G>A、c.1400A>C降低了 TGF-β经典信号通路中Smad3的磷酸化(p-Smad3),而c.4244T>G则下调了 TGF-β非经典信号通路中p38的磷酸化(p-p38)。Minigene实验确定了剪切突变c.3249-93249-5del和c.1582-6A>G均可以引起MYH3蛋白mRNA异常剪切,影响了正常的剪切位点的识别,导致全部或部分内含子的滞留,产生类似移码突变的蛋白破坏效应。通过总结本研究CS队列中19例携带MYH3基因突变的CS患者临床特征进行基因型-表型关联分析;在椎体畸形受累节段分布和类型方面,MYH3基因突变的患者椎体畸形受累节段常位于中下胸椎(尤其是T6-T10节段),且以椎体分节不良为主;MYH3突变患者更容易合并颌面部畸形和其他骨骼肌肉畸形。研究结论:MYH3基因是先天性脊柱侧凸的重要候选致病基因,MYH3基因的de novo错义突变显性致病遗传模式和复合杂合突变的隐性致病遗传模式扩大了 CS的基因突变谱;MYH3突变蛋白可能通过影响干扰TGF-β经典/非经典信号通路中关键蛋白的磷酸化导致椎体发育异常;基因型-表型关联分析发现MYH3基因突变的患者椎体畸形受累节段常位于中下胸椎(尤其是T6-T10节段),且以椎体分节不良为主。我们扩大了 MYH3基因突变致病表型谱,初步解释了 MYH3基因突变在CS的致病机制。