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背景甲状旁腺功能减退症（hypoparathyroidism,HP）,简称甲旁减,是因各种原因所致甲状旁腺素（parathyroid hormone,PTH）分泌不足,引起钙磷代谢紊乱的一类疾病。其病因包括颈部手术、外伤、外放射、自身免疫、遗传异常等。目前已发现有十数种基因突变与甲旁减的发病相关。既往关于大样本非手术性甲旁减患者全面基因筛查的研究数量有限,尚缺乏遗传性甲旁减系统的临床和分子遗传学概况研究。随着分子生物学诊断技术的发展,靶向目标序列的二代测序（targeted next-generation sequencing,T-NGS）已成为多种基因突变所导致的单基因疾病经济、快捷的检测方法,辅以较为简便的多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）则可同时对大片段缺失进行检测。目的本研究拟在一个单中心、大样本的儿童/青少年起病的非手术性甲旁减患者中:1)应用T-NGS+MLPA技术联合,探索单基因突变在起病年龄较早的非手术性甲旁减发病中的作用;2)通过体外功能实验验证某些新发现的突变位点的致病性;3)重点分析部分遗传性甲旁减的临床特点;结合遗传诊断策略探索甲旁减患者的基因诊断流程。方法在1975年至2018年间北京协和医院内分泌科门诊连续就诊的HP患者中,纳入起病年龄≤18岁、排除明确继发因素（包括颈部手术、外伤、外照射等）的患者,收集其临床资料和生化指标;自主设计包含15种HP相关候选致病基因的二代测序panel,使用T-NGS联合TBX1-MLPA,对受试者进行候选基因突变筛查,应用ACMG将变异分为致病、可能致病、意义未明、可能良性和良性。利用体外双荧光素酶报告系统验证TBX1和CASR新发现错义突变的致病性。基于基因突变检测结果及体外功能实验,对基因诊断明确的遗传性甲旁减的临床特征进行分析和总结。将检出良性/可能良性变异或无突变的患者定义为特发性甲旁减,与遗传性HP患者进行临床特征对比。结果本研究共纳入173例儿童/青少年起病非手术性HP患者。1)儿童/青少年起病非手术性HP的基因突变谱通过T-NGS测序,在23例患者中检出27个致病或可能致病变异,涉及TBX1、CASR、AIRE、GATA3、FAM1 1A 5种基因,其中13个为新发现的突变;通过TBX1-MLPA,25例患者检出了TBX1基因整个基因的单倍体缺失。突变检出率为 27.7%,按检出率高低依次为:TBX1（15.0%）、AIRE（5.2%）、CASR（4.6%）、GATA3（2.3%）和 FAM111A（0.6%）。此外,T-NGS 在 11 例患者中检出了 12个意义未明的变异,涉及GA TA3、CASR、FAM111A、GCM2和PTH5种基因。2)有突变和无突变患者的临床特征比较T-NGS测序和TBX1-MLPA联合,共检出了 48例有致病变异和114例无突变或携带良性变异的甲旁减患者。在有突变和无突变患者,HP在5岁前起病者分别有60.4%和7.0%。且在HP起病年龄5岁前者,突变检出率在60%以上。突变组与无突变组患者相比,甲旁减起病年龄更早（2.8[0.1,9.6]岁vs 13.0[8.8,15.0]岁,P=0.000）,甲旁减外表现和阳性家族史的比例更高（P<0.05）。3)本研究检出的部分变异功能验证及遗传性HP的临床特点分析（1）DiGeorge 综合征 1 型（DiGeorge syndrome type 1,DGS1）TBX1 突变体外功能验证及临床特点:26例DGS1患者,25例携带TBX1单倍体缺失,1例携带新发现的TBX1错义突变:c.A1469G（p.Y490C）。体外功能实验结果显示,该p.Y490C突变,较野生型相比,转录活性下降约50%。与114例特发性HP患者相比,26例DGS1患者低钙血症的起病年龄更早（4.5[0.2,10.3]岁vs 13.0[8.8,15.0]岁,P=0.000）;在病程相似的情况下,低PTH血症程度相对更轻（6.8[3.0,15.6]pg/mL vs 3.0[3.0,3.3]pg/mL,P=0.002）;在维持相似的血钙浓度下,每日需要相对较少剂量的维生素D制剂治疗（普通维生素D 3.25±1.62万IU/d vs4.90±1.85 万 IU/d,P=0.016;骨化三醇:0.35±0.15μg/dvs 0.64±0.31μg/d,P=0.059）。在23例无先天性心脏病的DGS1患者中,尽管已经出现了甲旁减外的表现（如特殊面容、智力障碍、言语含糊、反复感染等）,但在分子诊断前临床诊断仍存在困难。（2）常染色体显性遗传性低钙血症1型（autosomal dominant hypocalcemia type 1,ADH1）CASR突变体外功能验证及临床特点:在11例患者检出了 10种CASR错义突变,包括7个可能致病变异,分别为p.Q117R、p.D217Y、p.E241K、p.E767Q、p.F798V、p.F798C、p.Y839C,和 3 个意义未明变异,分别为 p.H429Q、p.A152V和p.I139T。体外功能实验结果显示,此10个变异在0.5mM、1mM、2mM、4mM胞外钙离子浓度下,较野生型相比,有不同程度的转录活性增加,量效曲线左移;证明了这些CASR可能致病变异和3个意义未明变异的致病性。故体外功能实验在T-NGS和TBX1-MLPA基础上,将突变检出率扩大为29.5%（51/173）。ADH1患者低钙血症起病较早,中位0.09[0.02,1.01]岁,10例血PTH水平在参考范围以下,9例在接受钙剂和维生素D制剂治疗后出现高钙尿症,7例合并低镁血症;且较IHP相比,HP发生年龄更早、尿钙水平更高、尿路结石的发生比例更高（P<0.001）。（3）身免疫性多内分泌腺病 1 型（autoimmune polyglandular syndrome type 1,APS1）的临床特点:本研究检出的9例APS-1患者中,平均随访至21.9±7.9岁,表现出中位4[1,5]个组分表现（范围1-7个）。2例具有典型三联征表现,包括甲旁减、念珠菌病和Addison病,3例具有三联征中2种表现;6例患者在病程中还有其他系统表现,包括外胚层发育不良、脱发、甲状腺功能减退症、卵巢早衰、视网膜色素变性、慢性腹泻等。（4）其他:在4例甲旁减-耳聋-肾发育不良（hypoparathyroidism-deafness-renal dysplasia,HDR）综合征中,3例具有该综合征典型的表现,包括甲旁减、听力障碍或肾发育不全。另有1例患者诊断为Kenny-Caffey综合征2型（Kenny-Caffey syndrome type2,KCS2）,除甲旁减外,临床有矮小、前囟闭合延迟、股骨和肱骨骨皮质增厚、骨髓腔狭窄,及小角膜、小眼球。结论在这个大样本的儿童/青少年起病的中国人非手术性HP病例系列中,对已知15种候选致病基因的突变检出率约30%。T-NGS和TBX1-MLPA技术联合是一种有效、经济、快捷的检测方法,体外功能实验对验证变异的致病性有重要作用。在本研究中检出的遗传性HP患者中,DGS1是最常见类型,TBX1基因单倍体缺失为最常见突变类型,可通过TBX1-MLPA有效检出,其临床表现多样,容易漏诊和误诊,需要治疗低钙血症的药物剂量较少,甲状旁腺有残存的功能。本研究诊断的其他遗传性HP还包括ADH1、APS1、HDR综合征和KCS2。新发现的突变位点扩大了 HP的基因突变谱。除外明确继发因素,对起病年龄早（尤其是5岁前起病）、有甲旁减外多系统表现和阳性家族史的HP患者,因DGS1在遗传性HP中高发,建议先行TBX1-MLPA筛查,筛查阴性者可考虑行T-NGS进行基因突变的检测。