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枯草芽孢杆菌属于食品安全级微生物(GRAS),广泛应用于生物防治、食品发酵、工业蛋白酶生产等。酱香是一种复合香,B.subtilis是酱香形成的主要微生物,迄今为止,酱香形成的分子机制仍不清楚。为探索酱香产生机制,研究通过对产酱香枯草芽孢杆菌BJ3-2和不产酱香枯草芽孢杆菌10075的3代基因组测序和转录组测序进行差异性分析,筛选得到9个酱香风味酶基因,确立靶基因rocG(谷氨酸脱氢酶)。结合实验室前期研究验证的酱香风味酶基因alsS(乙酰乳酸合成酶),针对两个靶基因rocG和als S,构建了四个CRISPR/Cas9敲除载体,主要研究内容及结果如下:1.通过产酱香枯草芽孢杆菌BJ3-2与不产酱香枯草芽孢杆菌10075共性蛋白对比,初步分析酱香风味的形成可能与基因重排有关。2.分析3代基因组测序和2代转录组测序结果,通过比较产酱香枯草芽孢杆菌BJ3-2和不产酱香枯草芽孢杆菌10075的基因组差异,基因表达量差异,结合模式菌株B.subtilis168和GO、KEGG等数据库,筛选获得酱香风味酶基因speD、rocF、hutG、PRODH、celF、hutI、celB、OxdD、rocG。3 按照sgRNA及供体donor设计原则,依照野生型枯草芽孢杆菌BJ3-2的全基因组中靶基因rocG、alsS序列,选取alsS 110f,alsS 527f,rocG 250r,rocG 456f共四条sgRNA,确定rocG及alsS donor左右臂。通过重叠PCR扩增出rocG及alsS的donor L+R,得到完整的同源置换臂。4.pHT01cas9-p43经过两次酶切,依次连接上sgRNA及donor,得到四个sgRNA+donor的重组质粒,分别为p43/sgRNA110/donor,p43/sgRNA527/donor,p43/sgRNA250/donor和p43/sgRNA456/donor。通过菌落PCR、质粒PCR及测序验证,成功构建了酱香风味酶基因rocG和alsS的CRISPR/Cas9敲除载体。研究为rocG和alsS酱香风味基因的功能研究奠定了基础,同时对探索酱香产生机制和实现GRAS级菌株基因的改良提供了有效的理论依据。