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超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内清除超氧阴离子的一类关键酶,能将有害的超氧自由基转化为过氧化氢和氧气,在植物抗氧化系统中发挥重要作用。目前对SOD基因家族的研究主要集中于被子植物,而该基因家族在裸子植物中的分子和功能特性还未被深入报道。对日本落叶松(Larix kaempferi)SOD基因家族的分子和功能研究对我们理解针叶树种抵抗氧化胁迫的机理具有重要的理论价值。本论文中,我们从日本落叶松中共克隆得到6个SOD基因,在基因表达、蛋白的亚细胞定位和功能层次上研究了落叶松SOD基因的分子和功能特征,获得如下结果: 1、从日本落叶松中共克隆并鉴定获得6个SOD基因,LkSOD1-LkSOD6,分为Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD三个亚类型。所编码的蛋白的长度介于153-259个氨基酸之间,预测的分子量为15.28-29.79kDa。序列相似性分析显示每个类型内SOD蛋白的相似性显著高于不同类型之间。蛋白结构模拟发现SOD蛋白具有该蛋白家族保守的三维结构。 2、半定量RT-PCR检测了这6个基因在正常生长条件下在不同部位的表达模式,发现6个基因在根、茎、叶、芽和茎的韧皮部均表达,且LkSOD3基因的表达量远高于其他基因。 3、对这6个基因所编码蛋白的亚细胞定位研究发现,3个SOD蛋白(LkSOD1、LkSOD3和LkSOD4)定位在细胞质,LkSOD2和LkSOD5定位在叶绿体,LkSOD6可能定位在叶绿体,说明SOD蛋白在功能上可能已经发生分化。 4、在大肠杆菌中表达并纯化了其中4个重组蛋白(LkSOD1-LkSOD4),酶学活性分析显示4个SOD蛋白对超氧阴离子都具有催化活性,且LkSOD3和LkSOD4蛋白的酶学活性比其他2个蛋白高,表明这些成员间可能已经发生功能分化。温度依赖性表明4个蛋白均具有比较宽的温度范围,但最适反应温度和范围区域已经产生差异。热力学稳定性结果显示,LkSOD2蛋白在40℃处理下一直保持60%以上活性,而LkSOD3处理30min已经完全失活,4个蛋白的热稳定性已经发生明显分化。 5、选取了代表不同类型的3个SOD基因(LkSOD2、LkSOD4和LkSOD6)在拟南芥中过量表达,结果发现3个基因的转基因株系相对于野生型植株,在盐胁迫下,种子萌发率增加,根部发育更为发达,这预示着转基因株系有更强的耐盐性。 通过基因表达、亚细胞定位、酶学性质和转基因拟南芥过量表达,本论文从不同层次上阐述了日本落叶松SOD基因的分子和功能特征,为进一步揭示裸子植物SOD基因家族在植物逆境胁迫中的作用奠定了基础。