研究目的骨质疏松症是一种以骨量低下、骨微结构破坏,导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的系统性、全身性骨病。在老年人群及绝经后妇女中骨质疏松发病率很高,严重影响了生活质量。据统计,60岁以上老年人中,患此症的比例达60%-80%,骨质疏松症已成为一个全球性的健康问题,该病的预防和治疗已经成为我国公共卫生事业面临的严峻问题。目前,用于治疗骨质疏松的药物可分为1、抗骨吸收的药物,如降钙素、维生素D、雌激素、双膦酸盐等。2、增加骨形成的药物,如氟化物、甲状旁腺激素等。3、具有促进骨形成和抑制骨吸收双重作用的药物,雷奈酸锶(strontium ranelate)。由于雷奈酸锶在抑制骨吸收的同时促进骨的形成,因此,比起传统的治疗骨质疏松症药物,雷奈酸锶在影响骨代谢方面具有双重作用,锶盐代表了在骨质疏松症治疗史上一个新的发展方向。目前对其在抗骨质疏松症方面的研究已成为热点。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是一种多潜能成体干细胞,具有向成骨细胞分化的能力。在BMSCs向成骨细胞分化中,受到多种信号通路调控,其中TGF-p(研究转化生长因子β1、transforming growth factor β1)、 BMPs(骨形态发生蛋白,bone morphogenetic proteins)、Wnt、MAPK(丝裂原活化蛋白激酶,mitogen-activated protein kinase)和Hedgehog(刺猬蛋白信号通路)信号通路发挥了重要作用。TGF-β在骨形成和骨吸收中的平衡方面起重要作用,可促进骨髓间充质干细胞向成骨分化,抑制其向破骨细胞分化,它在骨重建过程中的作用逐渐成为人们研究的热点。Smads蛋白直接参与TGF-β超家族成员的信号转导过程,它作为TGF-β下游的信号蛋白分子,将TGF-β信号从细胞外转导到细胞核内,是TGF-β信号转导通路的始动因子。Runx2又称为核心结合因子al (Cbfα1),是一种多功能转录因子蛋白,在成骨细胞的分化和骨形成方面起重要的作用,TGF-β、BMP-2等多种因子可作为Runx2的上游调节因子调节Runx2的活性。我们前期研究已经证实Sr可通过上调TGF-β1和Runx2表达来促进BMSCs向成骨细胞分化。因此,本实验在前期研究基础上进一步阐明Sr是否通过TGF-β1/Smad信号通路诱导BMSCs向成骨分化。1.材料与研究方法1.1、BMSCs的获取取四周龄SD大鼠颈推脱臼处死,75%乙醇浸泡5-10min,无菌操作下取双侧股骨和胫骨,剪去干垢端,用无菌注射器吸取含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素G和100mg/ml链霉素的DMEM/F12培养液反复冲洗骨髓腔得到骨髓细胞悬液,并移至15ml离心管；1000r/min,5min离心,制成单细胞悬液,以1-3x105cells/cm2接种于25cm2培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱内进行培养；24h后半量换液,以后每2-3d换液一次；倒置显微镜下观察细胞,至细胞融合至80%时进行传代,此后每隔3-4d传代一次。1.2、BMSCs的成骨诱导选取第3-5代BMSCs,将细胞种植于培养皿或培养板中,待细胞贴壁后加入成骨诱导液(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素、10-8mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/ml抗坏血酸的DMEM/F12培养基)培养。1.3、Western blotting法检测p-Smad2、Smad2和Runx2蛋白的表达水平选取第3代细胞,接种于60mm培养皿中,收集细胞时,先用预冷的PBS洗2遍,加入细胞裂解液,4℃裂解20-30min,在冰上用预冷的细胞刮刀将细胞刮下移至1.5ml EP管中,12000r/min离心10min,取上清液移至新的EP管中。应用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白浓度测定。经SDS-PAGE垂直凝胶电泳分离后,9V30min转膜,转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1h后分别加入p-Smad2抗体(1：1500)、Runx2抗体(1：500)及GAPDH(1：5000),4℃摇床孵育过夜,TBS/T5min洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：2500)孵育1h,之后TBS/T5min洗3次,最后用发光试剂ECL显色,曝光,曝光后用TBST洗膜2-3h,加入Smad2(1：1000)抗体。用Smartview软件分析目标条带灰度值,与内参Actin条带灰度值校正后进行半定量分析。1.4、小干扰技术设计3条Smad2特异性siRNA及1条阴性siRNA。操作时带手套,使用去RNA酶的枪头、EP管、试剂。瞬时离心后,用灭菌ddH2O将siRNA冻干粉配成20μM储存液,分装保存,避免反复冻融。转染前一天,接种适当数量的细胞至培养板或皿中,用不含双抗的培养基培养细胞,置于37℃、5%CO2培养箱中过夜,使转染时的细胞密度达60%-70%。转染时先制备siRNA-Lipo2000混合液：先用不含血清的培养基Opti-MEM分别稀释siRNA储存液、Lipo2000,分别轻轻混匀,室温放置5min后,将两种混合液轻轻混匀,室温下孵育20min,将siRNA-Lipo2000混合液加入不含双抗的细胞培养基中,混匀。6h后弃去混合液,更换新鲜不含双抗的培养基,培养2-3d后进行加药处理.1.5、real-time PCR法Smad2、Runx2基因的表达选取第3代培养细胞,调节细胞数为1×105/ml接种于25mm培养皿,每皿接种细胞悬液1mL,各实验组给予不同的处理因素后,分别于不同时间点提取细胞RNA进行基因表达的检测。1.6、ALP活性的检测选取第3-5代BMSCs接种于24孔板,各实验组给予不同处理因素后,在第7d采用酶标法检测ALP活性。检测时将细胞收集后以0.2%TritonX-100裂解液裂解,裂解后用PBS洗2遍,12000r/min离心10min,取上清液按试剂盒说明书进行操作,于酶标仪490nm波长处测定结果。1.7、茜素红钙化结节染色选取第3代BMSCs,接种于24mm×24mm六孔板中,六孔板底部预先置入消毒过的载玻片。各组给予相应处理因素后,于第21天对样本进行固定、染色及澄清处理。以上各步骤严格按照细胞茜素红钙染色试剂盒说明书进行。倒置显微镜下观察钙结节染色并拍照,每组取4个样本,每样本随机取1个视野(×100),比较各组间的差异。1.8、统计学处理全部结果以x±s表示,经SPSS13.0统计学软件进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验,各组经Levene方差齐性检验,方差齐,进一步多重比较用LSD检验,方差不齐,运用Weld校正法进行分析,进一步用Dunnett T3比较法进行多重组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。2.研究结果2.1、Sr上调p-Smad2表达用0.1mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L和10mmol/L Sr分别处理BMSCs1h后,与对照组相比,细胞内P-Smad2表达均升高,差异均有统计学意义(P<0.01),各组间P-Smad2表达差异有统计学意义(F=1261.798,P<0.01)；其中当Sr浓度为1mmol/L时,p-Smad2的表达水平的均数最大,与其余各组相比差异均有统计学意义(P<0.01),可以认为当Sr浓度为1mmol/L时, p-Smad2的表达达到峰值,当Sr浓度为3mol/L、5mol/L和10mol/L时,p-Smad2的表达呈逐渐减少趋势,但仍高于对照组(P<0.01)。用1mmol/L Sr分别处理rBMSCs15min、30min、60mim、120min和360min,与对照组相比,细胞内P-Smad2表达均升高,差异均有统计学意义(P<0.01),各组间P-Smad2表达差异有统计学意义(F=723.554,P<0.01),其中当Sr作用时间为60min时p-Smad2的表达水平的均数最大,与其余各组相比差异均有统计学意义(P<0.01),可以认为当Sr作用时间为60min时,p-Smad2的表达达到峰值,Sr作用时间为120min和360min时p-Smad2的表达水平呈逐渐减小趋势,但仍高于对照组(P<0.01)。2.2、Sr上调Runx2表达用lmmol/L Sr分别处理rBMSCsld、3d、5d和7d,与对照组相比,细胞内Runx2表达均升高,差异均有统计学意义(P<0.01),各组间Runx2表达差异有统计学意义(F=58.106,P<0.01),其中当Sr作用时间为5d时Runx2的表达水平的均数最大,与其余各组相比差异均有统计学意义(P<0.01),可以认为当Sr作用时间为5d时,Runx2的表达达到峰值,Sr作用时间为7d时Runx2的表达水平较第5d有所减少,但仍高于对照组(P<0.01)。2.3、TGF-β1阻断剂拮抗Sr对p-Smad2表达的上调作用用1mmol/L Sr处理BMSCs1h后,与对照组相比,p-Smad2表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)；用TGF-β1特异性阻断剂SB431542预处理BMSCs1h后,再用Sr处理BMSCs1h,细胞内p-Smad2的表达较单纯Sr处理组明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。2.4、Smad2siRNA有效链的筛选设计三条Smad2小干扰RNA siRNA001、siRNA002、siRNA003,分别转染BMSCs后,再用成骨诱导液处理细胞,与空白对照组相比较,小干扰组中Smad2蛋白(Western blotting法)、Smad2mRNA (Real Time PCR)的表达减少,差异有统计学意义(P<0.01),其中Smad2siRNA003转染组Smad2蛋白(Western blotting法)、Smad2mRNA(Real Time PCR)表达的均数水平最小,与siRNA001、 siRNA002组相比,差异有统计学意义(P<0.01),可认为Smad2siRNA003干扰Smad2蛋白的表达的作用最强。2.5、Smad2siRNA抑制Sr诱导p-Smad2表达的上调用1mmol/L Sr处理BMSCs1h,与对照组相比,p-Smad2表达水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),Smad2siRNA转染BMSCs后,再予以1mmol/LSr处理细胞,细胞内p-Smad2的表达较Sr组减少,差异有统计学意义(P<0.01)。2.6、Smad2siRNA抑制Sr诱导Runx2表达的上调。用lmmol/L Sr处理BMSCs lh,与对照组相比,Runx2蛋白(Western blotting法)、Runx2mRNA (Real Time PCR)表达水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.01), Smad2siRNA转染BMSCs后,再予以1mmol/L Sr处理细胞,细胞内Runx2蛋白(Western blotting法)、Runx2mRNA (Real Time PCR)的表达较Sr组减少,差异有统计学意义(P<0.01)。2.7、Smad2siRNA抑制Sr诱导ALP活性的增加用1mmol/L Sr处理BMSCs7d,与对照组相比,ALP活性明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)；Smad2siRNA转染rBMSCs后,再用1mmol/L Sr处理BMSCs7d,与Sr处理组相比,Sr对ALP活性的促进作用受到明显抑制,差异有统计学意义(P<0.01)。2.8、Smad2siRNA抑制Sr诱导钙结节数量的增多用1mmol/L Sr处理BMSCs21d,与对照组相比,钙结节的数量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),Smad2siRNA转染rBMSCs后,再用1mmol/L Sr处理BMSCs21d,与Sr处理组相比,钙结节增加数量明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。3.结论(1)在Sr诱导BMSCs分化为成骨细胞过程中,Sr上调了p-Smad2、Runx2的表达。(2)TGF-β1特异性阻断剂SB431542拮抗Sr对P-Smad2表达的上调作用。(3)应用小干扰技术干扰Smad2表达后,Sr诱导的p-Smad2、Runx2的表达明显减少,且ALP、钙结节表达也明显减少。上述结果提示,TGF-β1/Smad2/Runx2通路介导雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。