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PCV-2属于圆环病毒科(Circoviridae)，可引起猪断奶后多系统衰竭综合症(PMWS)，给世界养猪业造成相当大的经济损失。到目前为止，对该病的致病机理还不完全清楚。PCV-2有11个阅读框，目前已知ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，而ORF2则因其编码的蛋白具有良好的免疫反应性而成为一个研究热点，但针对其他阅读框的研究却很少。本研究通过PCR扩增，以PCV-2-HZ0201为模板成功克隆了PCV-2-ORF3，ORF4基因，以PCV-2美国株为模板克隆了ORF5基因，并成功构建了ORF3，ORF4，ORF5基因的原核表达载体，得到了ORF3，ORF4的纯化蛋白，并利用绿色荧光蛋白(EGFP)对上述三种基因编码的重组蛋白进行了真核PK-15细胞定位观察，为进一步研究这些蛋白打下了基础。 具体结果如下： 1．根据PCV-2核酸序列设计合成特异性引物，采用融合PCR技术对影响PCV-2 ORF3在E．coli中表达的稀有密码子进行改造，构建了pGEX-4T-1-ORF3表达载体，同时我们也构建了PCV-2 ORF4、ORF5基因的原核表达系统。 2．SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明，PCV-2 ORF3、ORF4和ORF5基因编码产物在E．coli中成功表达，并可被抗GST多抗特异识别，其分子量分别为37.7、32.5和35kDa。同时，改造后的ORF3基因成功表达也证明稀有密码子是影响外源基因在E．coli中表达的重要因素。 3．重组蛋白PCV-2 ORF3和ORF4经超声波裂解后SDS-PAGE电泳分析，这两种重组蛋白在E．coli中以包涵体形式存在，包涵体蛋白虽经溶解变性及复性处理，用Hitrap亲和柱纯化蛋白仍没有得到纯化蛋白，说明PCV-2 ORF3、ORF4的编码蛋白与GST融合后可能改变了原有GST蛋白的空间构象，影响与亲和琼脂糖凝胶的结合。我们用割胶法纯化重组PCV-2 ORF3和ORF4蛋白用于制备其单克隆抗体。 4．为研究PCV-2 ORF3，ORF4，ORF5基因编码产物在真核PK-15细胞中的表达和定位，构建了pEGFP-ORF3、pEGFP-ORF4、pEGFP-ORF5真核表达载体，共聚焦荧光显微镜观察证实这三种重组基因所编码蛋白都能在真核细胞表达，被转染细胞呈现萎缩和凋亡，指示重组PCV-2 ORF3、ORF4、ORF5蛋白对PK-15细胞有一定毒性；从细胞定位的角度看，这三种重组蛋白在PK-15细胞的细胞核和细胞浆内都出现了绿色荧光。