猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)是一种具有囊膜的正链RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属。其基因组由5’非编码区、3’非编码区和一个大的开放阅读框(ORF)组成。ORF编码一种由约3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，该多聚蛋白在病毒和细胞酶的作用下加工成4种结构蛋白和8种非结构蛋白，其中非结构蛋白NS5B，即RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，是病毒复制酶最重要的组成部分。 一般认为猪瘟病毒基因组RNA的复制同其它正链RNA病毒RNA的复制类似：首先以基因组正链RNA为模板合成互补的负链RNA，然后再以合成的负链为模板起始子代病毒基因组正链RNA的合成，因此基因组正链和负链RNA模板的3’末端可能含有起始RNA复制所必需的顺式作用调控元件，如启动子、增强子等。目前研究表明正链RNA病毒RNA依赖的RNA聚合酶起始基因组RNA合成的分子机制主要有两种：引物依赖的RNA合成(Primer-dependent RNAsynthesis)和引物非依赖的RNA合成即从头合成(De novo RNA synthesis)。已有报道表明，表达猪瘟病毒NS5B蛋白的昆虫细胞粗提液起始RNA的合成主要是通过引物依赖的RNA合成机制(为模板引物)，然而昆虫细胞中存在着末端转移酶的活性，有可能在RNA模板3’末端添加额外的核苷酸并作为引物起始RNA合成，导致RNA合成方式发生改变。 为了深入了解猪瘟病毒起始基因组正链和负链RNA合成的分子机制，同时建立体外RdRp复制系统，我们利用RT-PCR的方法扩增NS5B基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达NS5B蛋白。为了提高蛋白的可溶性表达，将NS5B C末端24个氨基酸的疏水序列缺失，并构建表达载体pET-NS5BA 24，通过组氨酸亲和层析柱纯化到一定量的可溶性蛋白。RT-PCR和实时荧光定量PCR的结果证明从大肠杆菌中纯化的NS5BA94蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶活性。 分别以病毒正常的基因组RNA和3’-OH封闭的RNA为模板，通过Northernblot分析和RT-PCR的方法对猪瘟病毒RdRp起始病毒RNA合成的分子机制进行研究。结果表明，猪瘟病毒RdRp主要是通过引物非依赖的3’末端从头合成机制起始病毒正链和负链RNA的合成。在以负链RNA为模板的反应中发现，RdRp除了以从头合成机制起始RNA合成外，还可以通过模板转换的方式合成高分子量的RNA。随后以(-)IRES为模板，对RdRp合适的反应条件进行摸索，发现csFv RdRP既能在镁离子(MgZ+)也能在锰离子(N加2+)存在的反应体系中起始RNA合成，但在N伪2+存在的情况下其活性更高，如果没有MgZ+或N位2+离子Rdl切就不能合成新生的RNA。高浓度三磷酸核昔酸(N仰)预孵育能够增强Rdl切合成正链和负链RNA的能力。将正链和负链RNA模板3’末端的胞啥吮C (即模板起始核昔酸，T+:)突变为尿啼陡(U)、腺嚎吟(A)或鸟嗓吟(G)都将导致RNA合成能力明显下降，表明模板3’末端起始核昔酸对起始RNA合成具有重要作用。将正链RNA模板的3’末端C突变为U后，其活性要比突变为G或A时的活性相对要高，而负链RNA模板的3’末端C突变为G后，Rd助也能合成少量的新生RNA，表明3’末端的其它序列对起始RNA合成可能也有一定的影响。 在病毒Rdl切起始基因组RNA合成过程中，RNA依赖的RNA聚合酶通过与起始三磷酸核昔酸(NTPi)，模板起始核昔酸(T+:)以及模板RNA等形成起始复制复合体以后才能有效起始病毒基因组RNA的合成。本实验通过No川五一Westem blot的方法证明了复性后的CSFV Ns5B似4蛋白能够与正链和负链RNA模板相结合，模板竞争试验表明这种结合是特异性的，表明Ns5BC末端的疏水序列对RdRP的识别与结合活性是非必需的.体外RdRP复制系统的建立为深入研究CSFV基因组RNA复制的顺式、反式作用调控元件奠定了基础。 细胞转染试验发现CSFV全长RNA依赖的RNA聚合酶主要是定位在核膜周围，而C末端截短的RdRP则分布于细胞核内，并形成聚集状。表明虽然RdRPC末端24氨基酸的疏水序列对RdRP的识别与结合活性是非必需的，但它可能作为膜锚定序列起作用。将RdRPC末端24个氨基酸的疏水序列连接到绿色荧光蛋白(GFP)下游，瞬时表达发现24个氨基酸不能完全将外源GFP引导至细胞核膜周围。 对猪瘟病毒NSSA基因的功能了解甚少，一般认为非结构蛋白是病毒复制酶的组成成分，在病毒基因组RNA的复制中起调控作用。我们通过体外表达GsT.Ns5A的融合蛋白来探讨Ns5A在CSFv RdRP起始RNA合成中的作用。细胞转染试验发现NSSA分布于细胞核和细胞质内。