论文部分内容阅读
近年来,利用肿瘤微环境的独特性来设计具有相关刺激响应开关的纳米药物递送系统已经成为癌症治疗的有效策略,其中肿瘤组织的酸性微环境常被用于设计具有pH靶向的药物递送系统。在本研究中,对抗癌药物阿霉素（Doxorubicin,Dox）进行改性修饰,制备了一种具有pH响应性的新型阿霉素腙配合物（Hydrazone-Dox）,其不仅具有对酸敏感的腙键,还具有易于被层状双氢氧化物纳米颗粒（Layered double hydroxide nanoparticles,LDHs）装载的羧基基团。利用离子交换法制备得到了具有pH响应性的阿霉素-层状双氢氧化物控释体系（Hydrazone-Dox-LDHs）,并对该载药体系的载药性能、理化性质、体外释放性能以及细胞水平的抑瘤效果和作用机理进行了研究。主要工作概括如下:LDHs的制备与表征:利用水热合成法制备了生物领域应用广泛的含Mg2+、Al3+和NO3-的层状双氢氧化物,并考察了金属离子摩尔比例以及水热温度对LDHs形貌结构、粒径尺寸、层电荷性质、结晶程度以及层间距的影响。利用透射电子显微镜和X-射线衍射对LDHs进行表征,实验结果表明成型的LDHs呈正六边形结构。随着水热温度的升高,LDHs的结晶度增加,颗粒尺寸逐渐增大,且聚集程度减弱。Zeta电位结果表明,所有成型的LDHs的电位值都大于35 mV,能够较稳定的存在。Mg2+/Al3+摩尔比越大,LDHs的电位值越小。而水热温度和金属离子摩尔比例对LDHs层间距的影响规律不明显。当水热温度为100℃,Mg2+/Al3+摩尔比为3时,LDHs的层间距最大,且结晶性较好,此时颗粒尺寸为104.33 nm±14.15 nm,因此选择该条件下合成的LDHs进行后续实验。纳米载药体系Hydrazone-Dox-LDHs的制备和表征:利用肼甲酸甲酯与盐酸阿霉素进行反应,合成了具有pH响应性的阿霉素腙配合物,其产率为81.2%±2.14%。并利用核磁共振氢谱鉴定其化学结构。运用离子交换法进行载药体系的构建,并考察了药物和载体的质量比对载药量和包封率的影响。随着投药比的增加,Hydrazone-Dox-LDHs的载药量逐渐增加,当投药比大于1/5时载药量维持在4.22%左右,而包封率随着投药比的增加呈先增加后减少的趋势。利用红外光谱、X-射线衍射、热重分析和紫外吸收光谱等对载药体系进行表征,证明了Hydrazone-Dox被成功装载于LDHs层间。利用pH值为5.0和7.4的缓冲液分别模拟肿瘤微环境和正常组织环境,观察Hydrazone-Dox-LDHs的体外释药行为。实验结果表明,载药纳米颗粒在pH值为5.0的酸性环境中药物释放效率显著高于其在pH值为7.4的缓冲液中的药物释放效率,且在pH=5.0的缓冲液中药物Dox可以持续释药120多个小时,Hydrazone-Dox-LDHs在酸性环境中具有pH响应的可持续释放性能。纳米载药体系在细胞水平的抑瘤效果研究:采用HeLa和MCF-7细胞考察不同样品的抑瘤效果。细胞MTT实验和溶血实验证明了LDHs具有良好的生物相容性。MTT法检测结果发现,Dox和Hydrazone-Dox对同一种癌细胞的毒性作用无显著性差异,Hydrazone-Dox-LDHs对两种癌细胞的毒性作用明显强于游离Dox,与流式细胞凋亡结果一致。用LDHs装载Hydrazone-Dox显著提高了Dox的抗癌效果。流式细胞周期结果表明Hydrazone-Dox-LDHs对HeLa细胞的S期和G2/M期表现出显著的阻滞作用。纳米载药体系在细胞水平的作用机理研究:利用激光共聚焦显微镜观察样品的细胞摄取情况。实验结果表明,Dox通过被动扩散进入HeLa细胞内,然后再扩散到达细胞核附近。Hydrazone-Dox-LDHs载药纳米颗粒则通过内吞作用进入细胞,随后通过pH触发的质子海绵效应使Dox从溶酶体逃逸,最终扩散到细胞核内。AO染色结果表明,Hydrazone-Dox-LDHs能够破坏HeLa细胞的溶酶体膜的通透性。利用DCFH-DA探针检测样品在HeLa细胞中的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生情况,孵育24 h后,Hydrazone-Dox-LDHs在细胞内产生的活性氧浓度约为同等载药量浓度的Dox的3倍,利用LDHs递送Hydrazone-Dox可以显著提高药物的活性氧产生能力。根据以上实验结果可以看出Hydrazone-Dox-LDHs主要通过两种途径诱导癌细胞的凋亡。一方面,载药纳米颗粒在溶酶体中会引起质子海绵效应而破坏溶酶体的通透性,溶酶体水解酶如组织蛋白酶通过溶酶体膜渗透（Lysosome membrane permeabilization,LMP）作用释放到胞浆中,诱导癌细胞凋亡。另一方面,Dox通过产生ROS破坏细胞膜结构和DNA,也将导致肿瘤细胞的凋亡。综上,制备得到的Hydrazone-Dox-LDHs纳米药物递送系统具有pH响应的缓释性能,可以显著提高抗癌药物Dox的抑瘤效果,有望成为高效的抗癌药物递送系统之一。