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研究背景和目的树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是目前已知的抗原作用最强的专职抗原递呈细胞,被认为是连接特异性免疫和非特异性免疫应答的桥梁,并且可决定机体特异性免疫应答的类型。DCs起源于骨髓前体细胞,经过一系列的发育分化成为不同的亚群:即单核样DCs、浆细胞样DCs(plasmacytoid DCs,p DCs)及经典DCs(conventional DCs,c DCs)。肠道中DCs主要分布在肠道固有层(Lamina propria,LP)和肠道相关淋巴组织中,包括了派尔集合淋巴结(Peyer’s patches,PPs)和肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph nodes,MLN)等,肠道DCs有许多不同的特异性亚型,其形成与肠道微环境和细胞因子有关,CD103~+CD11b~+DCs是小鼠小肠固有层(Small intestine lamina propria,SI-LP)中主要的DCs亚群。DCs能严密监视通过肠粘膜屏障移位的细菌和病原菌,不断摄取抗原并将其携带进入次级淋巴结,在淋巴结内激活初始T和B淋巴细胞,诱导特异性免疫反应。肠道特定DCs亚群能够分泌多种细胞因子影响初始辅助性T细胞(T helper cells,Th cells)向Th1、Th2或Th17等分化,从而参与不同类型的免疫应答反应。肠道正常功能的维持有赖于免疫和耐受之间的精确平衡,对微生物免疫调控失常将导致肠道慢性炎症,如炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)。由此可知肠道DCs在肠道黏膜免疫稳态中扮演着至关重要的角色,然而关于肠道DCs不同亚群的特性及其调节的研究尚不深入。信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα,SIRPα)是一类具有抑制性的跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,选择性表达在髓系细胞和神经细胞膜表面。胞质区高度保守,具有富含酪氨酸残基的免疫抑制性基序(Immune receptor tyrosine inhibitory motif,ITIMs),多种生长因子、细胞因子能够诱导其酪氨酸磷酸化。SIRPα胞外区由三个免疫球蛋白超家族结构域(Immunoglobulin super family domain,Ig SF)组成,SIRPα通过胞外区与其配体CD47相互作用,介导免疫抑制反应。许多研究表明SIRPα-CD47通路能够参与DCs的发育成熟和促进DCs的抗原递呈功能等。小鼠肠固有层SIRPα的缺失会导致CD103~+CD11b~+DCs亚群和肠黏膜Th17细胞数量减少,柠檬酸杆菌感染引起的Th17反应减弱。也有研究表明小鼠肠道固有层中CD11c~+CD11b~+DCs高表达SIRPα,其能促进鞭毛蛋白诱导的IL-17a、IFN-γ和IL-6等的产生,从而促进初始CD4~+T细胞向Th17和Th1的分化。综上提示我们SIRPα可能通过调节DCs和Th17的数量和功能参与肠道免疫稳态,然而SIRPα影响肠道DCs稳态的确切机制以及对肠道免疫微环境的影响仍不清楚。本课题中,我们通过TALEN技术构建了SIRPα全身性敲除小鼠,通过流式检测小鼠脾脏、肠道固有层和淋巴结组织中DCs、巨噬细胞(Macropages,Mφ)和T细胞各亚群数量和比例,探究SIRPα在肠道免疫稳态中的作用。为了进一步明确SIRPα的功能,我们采用Cas9/RNA基因打靶技术,使用Loxp/Loxp-Cre系统构建了DCs和Mφ上SIRPα特异性敲除小鼠,通过流式检测肠道淋巴组织中免疫细胞亚群的数量和比例,深入探讨DCs和Mφ等不同来源的SIRPα对于肠道免疫系统的固有调节作用。体外利用共培养研究体系和中和抗体干预手段,初步探讨SIRPα发挥调节肠道DCs作用的机制。为了进一步探讨SIRPα对于肠道稳态的调节作用,我们通过16S r DNA测序对SIRPα敲除小鼠肠道菌群组成和多样性进行了检测。利用DSS诱导的肠炎模型,探讨了SIRPα在炎性肠疾病中作用。通过超高效液相色谱/质谱联用技术开展了SIRPα敲除小鼠胆汁酸组分分析,初步探讨了SIRPα对于胆汁酸代谢的调节作用,确定了SIRPα在肠道免疫和代谢稳态中的重要作用,为IBD和脂质代谢相关疾病的治疗提供新策略和新思路。实验方法1.采用TALEN技术构建了SIRPα全身敲除小鼠,采用Cas9/RNA基因打靶技术,使用Loxp/Loxp-Cre系统构建了DCs和Mφ上SIRPα特异性敲除小鼠动物模型;2.建立多色染色方案用于区分肠道DCs和Mφ,通过流式细胞仪检测小鼠脾脏、肠道固有层和肠系膜淋巴结中DCs和Mφ的数量和比例,通过胞内染色检测组织中T细胞亚群的数量和比例;3.体外诱导培养小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs),利用共培养体系,检测Mφ对于组织DCs、Th1和Th17等的吞噬作用;4.抗原特异性T细胞增殖实验。体外实验:脾脏纯化的DCs与OT-II小鼠来源的初始T细胞共培养4天,检测培养上清IL-17a浓度;体内实验:受体小鼠尾静脉注射OT-II初始CD4~+T细胞,1天后进行免疫接种,10天后分析肠道固有层Th17/Th1细胞的数量和比例;5.骨髓移植模型:受体小鼠接受致死性γ射线(Co60源)照射,从供体小鼠中分离骨髓细胞,通过尾静脉注射入辐照受体小鼠中;6.喂食2.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液构建小鼠肠炎模型;7.腹腔注射氯膦酸盐脂质体清除小鼠体内Mφ;8.小鼠肠道通透性检测。通过强饲法给予小鼠FITC标记的右旋糖酐水溶液,4小时后使用荧光光度仪检测小鼠血清中FITC标记的右旋糖酐浓度;9.通过16S r DNA测序检测小鼠肠道菌群组成和多样性;10.使用半自动生化分析仪检测血清生化指标。使用ELISA试剂盒检测组织和血清IL-6,IL-1β,TNF-α,IFN-γ,IL-17a和FGF15的浓度;11.使用超高效液相色谱(UPLC)-质谱联用系统检测小鼠粪便、血清和组织中的胆汁酸组成和含量。实验结果1.小鼠脾脏、小肠固有层和肠系膜淋巴结中Mφ均高表达SIRPα,而在DCs亚群中存在分化;2.SIRPα-KO小鼠脾脏CD4~+c DCs特异性减少,肠道固有层和肠系膜淋巴结中CD103~+CD11b~+DCs数量和比例特异性减少;3.造血细胞来源的SIRPα参与肠道DCs亚群的调节;4.DCs和Mφ上SIRPα特异性缺失均会导致脾脏CD4~+c DCs、肠系膜淋巴结和小肠固有层中CD103~+CD11b~+DCs数量的特异性减少。5.SIRPα依赖的CD103~+CD11b~+DCs影响肠道Th17/Th1细胞的产生;6.阻断SIRPα-CD47通路能够增强SLAMF7依赖的肠道CD103~+CD11b~+DCs和Th17/Th1的吞噬;7.SIRPα-KO小鼠肠黏膜上皮菌群数量增加且抗菌功能减弱,肠上皮细胞异常激活,胆汁酸代谢负反馈调节通路受抑制;8.SIRPα的缺失加重小鼠DSS诱导的肠炎症状;9.SIRPα-KO小鼠出现系统性胆汁酸水平升高。实验结论本研究利用SIRPα全身敲除小鼠和SIRPα条件性敲除小鼠模型,系统地研究了SIRPα在肠道免疫稳态中调节作用和分子机制,本课题研究发现SIRPα的缺失能够引起肠道和淋巴结中CD103~+CD11b~+DCs和Th17/Th1数量和比例的特异性减少;阻断SIRPα-CD47信号通路能够增强Mφ对特定DCs和T细胞亚群的吞噬作用,这一过程依赖于SLAMF7;小鼠肠道CD103~+CD11b~+DCs和Th17/Th1数量的减少,导致肠黏膜上皮菌群数量增加和肠上皮细胞异常激活,胆汁酸代谢负反馈通路受到抑制,进而引起系统性胆汁酸水平升高。综上所述,我们发现SIRPα依赖的CD103~+CD11b~+DCs在肠道免疫和代谢稳态中扮演着至关重要的角色。