甘蔗是广西重要的经济作物和糖料作物,其种植面积和产糖量约占全国60%以上。氮是植物生长中重要的营养元素之一,在甘蔗生长过程发挥重要的作用。氮肥的大量使用,使甘蔗的生产成本增加以及土壤和环境恶化,生物固氮对保持作物可持续发展有重要意义。本课题组从甘蔗品种ROC22中分离得到一株革兰氏阴性细菌Klebsiella varicola DX120E,具有固氮、溶磷和嗜铁等促生长特性。DX120E可与甘蔗进行联合固氮,对甘蔗具有促进生长作用,但关于DX120E固氮酶nifH基因缺失对其固氮作用和对甘蔗生长的影响还未报道。本研究构建DX120E固氮酶基因nifH的突变和回补菌株,并对其生理生化特性以及基因和蛋白表达差异进行分析,同时将突变和回补菌株回接甘蔗,研究其对甘蔗生长的影响。主要结果如下:1.采用CRISPR/Cas9技术对固氮酶nifH基因进行缺失与回补,成功构建了DX120E（WT）的突变菌株ΔnifH和回补菌株C（ΔnifH）。固氮酶活性的结果表明,基因nifH突变降低了固氮菌DX120E的固氮酶活性,但回补菌株和野生菌株的固氮酶活性差异不显著。2.不同氮源对野生菌株（WT）、突变菌株ΔnifH和回补菌株C（ΔnifH）生长的影响不同。菌株WT、ΔnifH和C（ΔnifH）在基本LB培养基中生长趋势相似,但在分别以尿素、硝酸钠和硫酸铵为唯一氮源的培养基中培养时,菌株ΔnifH的生长受到抑制。3.菌株对不同碳源利用和化学敏感测试试验结果表明,nifH基因的突变没有改变固氮菌DX120E利用碳源的种类,野生菌株、突变菌株和回补菌株都可利用糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、蔗糖、棉子糖等36种碳源,对p H6、1%Na Cl、1%乳酸钠、醋竹桃霉素、利福霉素等物质敏感。4.不同氮源对三个菌株固氮相关基因影响的q PCR分析表明,在以硝酸钠为氮源的培养条件下,C（ΔnifH）的nif D和nif K基因的相对表达量与WT相比分别上调了1.45倍和1.62倍;在以尿素为氮源的时,C（ΔnifH）的nif D的表达量与WT相比上调了1.19倍,与ΔnifH相比上调了2.27倍。添加硫酸铵为氮源培养时,C（ΔnifH）中nif D基因的相对表达量与WT相比上调了3.35倍,而nif K基因的表达则上调了8.62倍。Western bolt分析结果表明,与WT相比,ΔnifH的蛋白表达量降低,而C（ΔnifH）的表达量却比WT高。5.两个施肥水平下,接种野生型菌株能提高两个甘蔗品种的株高和叶绿素含量。ΔnifH处理的甘蔗株高低于WT处理,C（ΔnifH）处理的甘蔗株高与WT处理差异不显著。WT处理的甘蔗叶绿素含量高于CK和ΔnifH处理。接种野生菌株对甘蔗品种B8和ROC22叶片的硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性均有不同程度地提高,且甘蔗品种B8的硝酸还原酶活性总体上均高于品种ROC22,而nifH基因突变菌株处理降低了上述几个相关酶的活性。两个施氮水平下,WT处理的两个甘蔗叶片的蔗糖合成酶活性均高于CK和ΔnifH处理,而WT和C（ΔnifH）处理的甘蔗蔗糖合成酶活性差异不显著。接种野生菌株甘蔗叶片的硝态氮和铵态氮含量均比CK和ΔnifH处理高。两个施肥条件下,ROC22中ΔnifH处理的甘蔗含氮量比WT处理的低。