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Orexin（食欲素）是一类新发现的主要存在于下丘脑的神经肽，它由下丘脑外侧区域特异神经元表达的前体蛋白prepro-orexin经蛋白酶水解衍化而来，包括Orexin-A和Orexin-B两种。它们能与两个配对的G蛋白受体——OX1受体（OX1R）及OX2受体（OX2R）相结合。OX1R具有选择性，只与Orexin-A相结合，而OX2R具有非选择性，与Orexin-A和Orexin-B均可结合。近来研究发现，急性脑缺血可以导致OX1R表达改变，但是慢性脑缺血能否导致OXR表达改变在国内外尚未见报道。慢性脑缺血是血管性痴呆、Alzheimer病（AD）和Binswanger病等多种脑血管疾病发病过程中的一个共同的病理过程，随着我国老龄人口比例不断增大，慢性脑缺血带来的老年相关性疾病的发病率逐年增加，它困扰着许多老年人，给社会、家庭带来沉重的经济和精神负担，防治慢性脑缺血带来的老年相关性疾病日益显得至关重要。因此对慢性脑缺血相关疾病的发病机制及脑组织保护剂的研究已成为关注的焦点。近年来，随着对慢性脑缺血认识的加深，人们越来越认识到有效治疗慢性脑缺血的重要性，开始寻找一些药物来阻止或延缓脑缺血所致的脑损伤，从而达到有效防止慢性脑缺血相关疾病的发生、发展。药物治疗慢性脑缺血，尤其是中药治疗慢性脑缺血具有成本低、靶部位多、不良反应少、危害小等优点；同时我国是中药的发源地，有丰富的中药资源；另外由于先进的实验手段已广泛应用于中药的实验研究，使中药实验研究的客观性大大提高，因此开展中药治疗慢性脑缺血的研究十分具有可行性和广阔的发展前景。天麻钩藤饮具有平肝熄风、清热活血、补肾益智之功效，现代药理研究表明天麻钩藤饮有改善脑缺血再灌注动物学习记忆障碍的作用。另有研究表明天麻钩藤饮能通过降低NMDA受体活性、抑制兴奋性氨基酸神经毒性等途径发挥脑保护作用。鉴于以上考虑，本研究首先通过结扎双侧颈总动脉法建立慢性脑缺血大鼠模型，采用免疫组化、免疫荧光双标组化技术观察慢性脑缺血大鼠脑组织OX1R、OX2R的表达及其随缺血时间的变化，探讨慢性脑缺血能否导致OXR表达变化及其意义。在上述研究的基础上，探讨天麻钩藤饮能否通过Orexin系统发挥其脑保护作用，从而进一步证实天麻钩藤饮对慢性脑缺血的治疗作用。方法1．动物分组108只SD大鼠（雌雄各半），随机分为假手术组、模型组、治疗组，每组又分为15d、30d、60d三个亚组，每个亚组12只。各假手术组仅行颈前切开，不结扎颈总动脉，术后立即用蒸馏水（灌胃量与治疗组相当）灌胃15d、30d、60d；各模型组分别于建模成功后立即用蒸馏水（灌胃量与治疗组相当）灌胃15d、30d、60d；治疗组15d、30d、60d分别于建模成功后立即用天麻钩藤饮(0.5g·kg-1·d-1)灌胃15d、30d、60d。2．慢性脑缺血大鼠模型建造参照Yamada等制作慢性脑缺血大鼠模型的方法制作模型。3．大鼠学习记忆能力测试采用水迷宫法进行学习记忆功能测定。4．脑组织切片制备和脑组织OXR的免疫组化表达测定及免疫荧光双标组化和HE染色观察各亚组大鼠于各自时间终点断头处死，处死后取脑组织，10％福尔马林固定、常规石蜡包埋，连续冠状切片。每只大鼠脑组织标本取连续切片，分别用OX1R、OX2R抗体进行免疫组化染色。严格按SP染色试剂盒说明书进行免疫组化染色，光镜下采用盲法观察。镜下在每张切片相同部位的皮质、海马区随机计数5个视野1000个细胞，计出阳性细胞数。用图像分析仪分析每张切片OX2R在海马周围神经纤维着色的平均灰度值。每只大鼠脑组织标本取连续切片分别用OX1R、OX2R抗体与NSE抗体及其荧光素标记Ⅱ抗严格按照免疫荧光双标组化染色步骤对OXR进行免疫荧光双标组化染色，在激光共聚焦显微镜下观察OXR的表达。取各组大鼠脑组织切片严格按照HE染色步骤进行HE染色，在光镜下观察。5．统计学分析数据均以均数±标准差（（?）±s）表示，应用SPSS13.0进行单因素方差分析，取α=0.05作为检验水准。结果1．行为学评价假手术组15d、30d、60d之间比较无统计学差异（P＞0.05）。模型组15d逃避潜伏期较假手术组15d显著延长（P＜0.05）。模型组30d和模型组60d逃避潜伏期较模型组15d缩短（P＜0.05），但仍大于相应假手术组水平（P＜0.05），模型组60d的逃避潜伏期虽较模型组30d缩短，但二者之间无统计学差异（P＞0.05）。天麻钩藤饮干预组与其相应的模型组相比逃避潜伏期均缩短（P＜0.05）。2．慢性脑缺血大鼠OXR的表达假手术组15d、30d、60d之间比较无统计学差异（P＞0.05）。模型组15d的OXR表达较假手术组15d明显增加（P＜0.05）；缺血15d后OXR表达下降，模型组30d降至假手术组30d水平（P＞0.05）；模型组60d OXR表达再次增加，基本达模型组15d水平（P＞0.05）。3．慢性脑缺血大鼠OXR的免疫荧光双标组化及HE染色观察OX1R、OX2R均可与NSE共同表达于神经元。模型组15d较假手术组15d OXR表达明显增加且着色加深，部分神经细胞已萎缩变形，模型组30d较模型组15d OXR表达明显下降，大部分神经细胞体积缩小、胞核浓缩、深染、结构不清。模型组60d较模型组30d OXR表达明显增加，且部分神经细胞已恢复正常形态。4．慢性脑缺血大鼠OX2R在海马周围神经纤维的表达假手术组15d、30d、60d之间比较无统计学差异（P＞0.05）。模型组15d OX2R神经纤维着色平均灰度值明显大于假手术组15d（P＜0.05）；缺血15d后平均灰度值下降，模型组30d降至假手术组30d水平（P＞0.05）；30d后再次升高，模型组60d虽未达到模型组15d水平，但二者无统计学差异（P＞0.05）。5．天麻钩藤饮对慢性脑缺血大鼠OXR表达的影响治疗组15d，OXR的表达较模型组15d明显下降（P＜0.05）；治疗组30d，OXR的表达与模型组30d无统计学差异（P＞0.05）；治疗组60d，OXR的表达较模型组60d显著升高（p＜0.05）。结论1．OX1R、OX2R均在慢性脑缺血大鼠神经元有表达，且随缺血时间的延长呈升高、降低、再升高的双相样改变。2．OX2R除在慢性脑缺血大鼠神经元表达外，还在海马周围的神经纤维明显表达，其变化趋势同神经元。3．Orexin系统在慢性缺血性脑损伤的病理过程中，通过某种途径起到双向调控的作用。4．天麻钩藤饮可以通过Orexin系统对慢性脑缺血发挥治疗作用。