背景和目的由于流行病学数据、疾病自然史和临床诊疗管理数据的缺乏,杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)临床试验在中国的开展面临着许多挑战。为了提供这些重要的相关信息,我们基于中国南方DMD患者建立了综合数据库,并对患者的临床与基因突变特征进行分析。方法1.研究对象为确诊的DMD登记患者,患者的诊断通过临床表现、家族史、基因检测、预后和/或肌肉活检结果确定。临床信息运用数据库病例登记表进行规范化收集。2.DMD患者dystrophin基因大片段缺失/重复运用多重连接依赖性探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术检测。3.MLPA结果阴性的患者进一步用Sanger测序检测dystrophin基因微小突变。结果1.目前DMD综合数据库共包括141例DMD患者,分别来自137个家系,均来自中国南方地区。91.5%的患者在10岁以下。Dystrophin基因突变分析发现大片段缺失为最常见的突变类型,占57.7%,紧随其次的分别为无义突变(15.3%),大片段重复(10.2%),微小插入突变(7.3%),微小缺失突变(5.8%),以及剪接位点突变(2.9%)。大片段缺失热区位于45-54号外显子,但大片段重复未见明显的重复突变热区。MPLA结果阴性的44例患者均检测出微小突变,其中24个微小突变为新突变,未在Leiden数据库中报道过。2.临床分析发现大多数患者首发症状在1-3岁出现,但是诊断的高峰年龄在6-8岁。85.1%的患者能独立行走。基础的心功能评估中,42.6%的患者进行了心脏彩超检查,34%的患者进行心电图检查。仅23.4%的患者完成了基础肺功能评估。只有小部分患者(21.3%)既往或目前正在使用糖皮质激素治疗。3.15.3%的患者适合于终止密码子通读的无义突变治疗,47.4%患者可能通过单个外显子跳跃治疗受益。能使最多数DMD患者受益的前五位外显子跳跃治疗分别是51号外显子跳跃(占总突变数的14.6%),53号外显子跳跃(11.8%),45号外显子跳跃(7.3%),55号外显子跳跃(4.4%),以及44号外显子跳跃(3.6%)。结论1.我们基于中国南方DMD患者建立了综合数据库,并分析了数据库中DMD患者的临床和基因突变特征,提供了中国南方DMD患者的疾病自然史、DMD的诊疗管理现状及未来潜在的治疗策略等详细信息。该数据库有助于推动中国DMD临床试验和分子治疗的发展。2.中国南方DMD患者的突变类型依次为大片段缺失、无义突变、大片段重复突变、微小插入突变、微小缺失突变、剪接位点突变。3.报道了24个dystrophin基因新的微小突变。4.DMD患者存在明显诊断延迟现象,基础心肺功能评估率及激素治疗率均较低,DMD标准化管理需要更进一步推广与普及。5.约15.3%的DMD患者适用于无义突变治疗。外显子跳跃治疗适用于近半数的DMD患者,外显子跳跃治疗策略应首选51、53、45、55及44号外显子。背景与目的DMD治疗相关临床试验的设计和开展需要依托完善的DMD疾病自然史数据,特别是临床试验中最重要的疗效评价指标,即患者运动功能发展和变化数据。运用现阶段被大多数临床试验采用的标准化评估方式对DMD患者的运动功能进行评估和随访,对临床试验的开展和设计具有极大的参考价值。我们前期基于中国南方患者的数据表明,DMD患者存在明显诊断延迟且整体激素治疗率低,均会引起DMD患者运动功能的进展具有其自身特征性。目前,我国尚未有系统性地针对DMD患者运动功能变化的相关研究,更缺乏运用标准化测评指标对DMD患者运动功能进行规范化评估的研究。我们基于已经建立的DMD综合数据库,开展了前瞻性观察性队列研究,运用DMD指南推荐的标准化评估措施,对DMD患者的运动功能进行测评与临床随访,分析DMD患者运动功能的变化特征,以期为未来临床试验的开展和对照组的选择提供依据。研究方法1.研究对象来自本研究建立的DMD综合数据库,入组患者需能独立行走且配合测评。2.运用标准化运动功能评估指标,包括6分钟步行试验、North Star Ambulatory Assessment(NSAA)量表得分、10米跑/走时间和Gowers时间,对患者的基线运动功能进行测评。3.对患者进行12个月(±2个月)的临床随访和运动功能测评。4.根据患者的年龄和激素使用情况开展1:1配对研究,将DMD患者分为大片段缺失/重复组和微小突变组,比较两组患者运动功能是否存在差异。结果1.基线运动功能分析中,DMD患者在7岁前6分钟步行距离和NSAA量表得分呈总体上升趋势,10米跑/走时间在7岁前差异较小。7岁后患者6分钟步行距离和NSAA量表得分呈明显下降趋势,10米跑/走时间显著增加。Gowers时间随年龄增大呈逐步上升趋势。线性回归分析结果示患者7岁之后,随着年龄的增加6分钟步行距离每年平均下降30.4米(P<0.05),NSAA量表得分每年平均下降2.7分(P<0.05),10米跑/走时间随年龄增大每年平均增加1.0秒(P<0.05)。Gowesr时间随年龄增大每年平均增加1.1秒(P<0.05)。2.12个月随访结果分析,通过运动功能变化的散点图可见在病程相对早期,7岁开始运用激素治疗的患者,其6分钟步行距离和NSAA量表评分在12个月后趋于稳定,甚至有提高;但病程中后期,特别是10岁后使用激素治疗的患者,其6分钟步行距离和NSAA量表评分在12个月后仍有较明显下降。线性回归结果示DMD患者随着年龄增大,6分钟步行距离每年下降幅度平均增加46.3米(P<0.05),激素治疗组相对于未使用激素治疗组,其6分钟步行距离平均提高79.5米(P<0.05)。NSAA评分每年下降幅度平均增加1.7分(P<0.05),激素治疗组相对于未使用激素治疗组,其NSAA评分平均提高3.7分(P<0.05)。3.各运动功能测评指标之间均具有相关性(P<0.05),相关系数绝对值在0.74-0.88之间。4.在配对研究中,大片段缺失/重复组与微小突变组之间运动功能测评指标均无统计学差异(P>0.05)。结论1.本研究中来自我国南方的DMD患者运动功能变化具有明显的特征性,多数患者在7岁进入运动功能平台期,7岁后6分钟步行距离和NSAA量表得分随年龄呈进行性下降,10米跑/走时间和Gowers时间逐年递增,各运动功能测评指标随年龄变化的幅度较大,疾病的总体进展较快。2.DMD患者6分钟步行距离和NSAA量表得分每年下降的幅度随年龄增加而增大,年龄增加伴随患者运动功能下降加快。3.激素治疗的DMD患者相对于未使用激素治疗的患者,其6分钟步行距离和NSAA量表得分明显提高,激素有助于改善DMD患者运动功能。应注重运动功能进入平台期时激素的治疗,可能对运动功能的改善更加明显。4.大片段缺失/重复突变型与微小突变型患者的运动功能无明显差异。背景与目的随着治疗相关的基础研究和临床试验的推进,在杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)常见的突变类型中,大片段缺失突变和无义突变已在基因或转录水平发现了相对有效的修复方式,但DMD大片段重复突变目前尚缺乏合适的修复方式。DMD重复突变经修复后原理上可产生全长且有完整功能的dystrophin蛋白,不仅有望使重复突变患者得到完全治愈,亦有助于深入了解特定的修复方式在DMD疾病中所能发挥的最大作用和应用价值。新的基因编辑方式CRISPR/Cas9系统能够对基因组DNA进行精确的修复,为DMD重复突变的治疗指引了新的方向。本研究运用CRISPR/Cas9系统,直接针对多个外显子重复突变的DMD患者来源原代培养成肌细胞进行基因编辑,以探讨CRISPR/Cas9基因编辑技术对dystrophin基因多个外显子重复突变的基因编辑效果及其应用。研究方法1.取DMD重复突变患者的肌肉组织做原代细胞培养和冰冻切片dystrophin免疫组化染色。2.DMD重复突变患者重复突变断裂点检测。3.CD56磁珠分选原代培养细胞中的成肌细胞,分选后得到的CD56(+)细胞进行desmin免疫荧光染色,同时将分选得到的CD56(+)细胞诱导分化7天,观察细胞形态变化并进行MHC免疫荧光染色,以鉴定分选纯化后的成肌细胞。4.设计sgRNA并构建sgRNA表达载体,通过Lipofectamine 2000转染HEK293T细胞。sg RNA组转染连接有sg RNA的Px458载体,对照组转染空载Px458质粒。提取质粒转染后HEK293T细胞基因组DNA,进行PCR扩增后运用T7核酸内切酶检验sg RNA功能活性。值感染成肌细胞,经嘌呤霉素药物筛选后将成肌细胞诱导分化7天,提取细胞基因组DNA和总蛋白。6.荧光实时定量PCR检测基因编辑前后患者肌管细胞基因组DNA水平dystrophin基因6号外显子、25号外显子拷贝数相对于健康对照的变化情况。7.对预测的前10位可能脱靶位点进行PCR扩增,Sanger测序检测,评估脱靶效率。8.Western blot检测基因编辑后患者肌管细胞是否产生全长dystrophin蛋白,并根据条带灰度值估计dystrophin蛋白含量。9.运用免疫荧光检测基因编辑后患者肌管细胞膜蛋白复合物dystrophin和syntrophin蛋白的恢复情况。结果1.该DMD重复突变患者为18-25号外显子重复,重复断裂点位于25号内含子区,断裂点处直接连接17号内含子区,之间无异常序列插入。患者的肌肉组织冰冻切片免疫组化显示dystrophin蛋白中央杆状区、氨基端和羧基端染色均完全缺失。2.CD56磁珠分选后得到的CD56(+)细胞desmin免疫荧光染色示85%以上为desmin(+),分选得到的CD56(+)细胞经诱导分化7天后可形成长条形且多个核的肌管细胞,MHC免疫荧光染色(+)。3.Px458质粒转染HEK293T的效率约60%。sgRNA组转染后的HEK293T细胞基因组DNA经PCR扩增、T7核酸内切酶切割,产生明显的两条酶切条带,而对照组未见酶切条带,证实所设计的sg RNA具有功能活性。4.荧光实时定量PCR结果显示,dystrophin基因编辑前,患者肌管细胞6号外显子拷贝数相对于健康对照为0.841±0.029,基因编辑后6号外显子拷贝数相对于健康对照为0.889±0.023,差异无统计学差异(P=0.084)。Dystrophin基因编辑前,患者25号外显子拷贝数相对于健康对照为2.015±0.079,基因编辑后25号外显子拷贝数相对于健康对照为1.308±0.083,差异有统计学差异(P<0.001)。5.对预测的前10个脱靶位点进行Sanger测序均未发现异常编辑。6.Western blot结果示,dystrophin基因编辑前患者肌管细胞几乎无dystrophin蛋白表达,基因编辑后重新表达了全长427kd的dystrophin蛋白。灰度值分析显示,患者肌管细胞经过基因编辑后产生的dystrophin全长蛋白约为健康对照组6.12%。7.Dystrophin基因编辑后患者肌管细胞膜蛋白复合物dystrophin和syntrophin免疫荧光染色均为(+),膜蛋白复合物恢复。结论1.CRISPR/Cas9系统可对具有多个外显子重复的DMD重复突变型基因组DNA实现重复序列的完整切除。2.CRISPR/Cas9系统对DMD重复突变的重复序列切除后可以产生完整有功能的全长dystrophin蛋白,CRISPR/Cas9基因编辑技术可作为重复突变DMD患者的有效治疗方式。3.CRISPR/Cas9系统对DMD重复突变型的基因修复具有独特的优势,仅需单一的sg RNA即可介导完成大片段重复序列的切除。