低氧导致的组织损伤与炎症反应密切相关。已证实机体对缺氧损伤的习服与适应受糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)的影响。在低氧条件下分泌增多的GC能通过糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)的介导,调节基因表达,但是至今对于参与了低氧适应的糖皮质激素/受体(GC/GR)的靶基因还知之不多。糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白(Glucocorticoid induced leucine zipper,GILZ)是近年来发现的GC/GR靶蛋白,因其具有与GC类似的免疫抑制、抗炎、抑制细胞增殖等功能,被认为是GC作用的重要介导子,因此我们推测GILZ有可能参与了GC对低氧的保护作用。迄今低氧对GILZ的表达是否影响尚未见报道。本课题采用Real-time PCR及Western blot方法研究了低氧以及低氧和GC联合处理对大鼠脾脏和体外培养细胞中GILZ表达的影响,并初步探讨了其机制,以进一步阐明GC对低氧适应的机制。 一、在体低氧和GC协同上调GILZ的表达 首先在体观察了低氧能否导致GILZ表达的改变。将250～300g的健康雄性SD大鼠放入低氧舱(8％O2、92％N2)内暴露不同时间,采用Real-time PCR及Western blot方法检测大鼠脾和肺组织中GILZ的表达情况。结果发现,大鼠低氧暴露8h,12h,24h,脾组织中GILZ mRNA和蛋白的表达与对照相比均明显增加,其中低氧8 h大鼠GILZ mRNA表达水平最高,约为对照大鼠的2.2倍(p<0.05)。低氧12h组肺组织中GILZ mRNA表达约为对照的1.5倍(p<0.05)。 为了观察在体低氧上调GILZ是否受GC的影响,我们将大鼠随机分为假手术组、去腺(双侧肾上腺切除)常氧组、去腺地塞米松(dexamethasone,Dex)组(肌注5mg/kg)、去腺低氧组、去腺Dex(5mg/kg)和低氧联合处理组,不同处理12h后检测脾组织GILZ的表达。结果显示,单纯去腺组GILZ mRNA降低至假手术组的44％(p<0.01),给去腺大鼠肌注Dex处理后,其脾脏GILZ的mRNA水平明显增高,约为去腺大鼠的13倍(p<0.01);去腺低氧组与单纯去腺组相比GILz的mRNA变化不明显,但去腺后Dex联合低氧处理组大鼠脾组织中GILZ的mRNA表达显著高于去腺低氧组,约为去腺低氧组大鼠的10倍(p<0.01),也明显高于去腺Dex组,约为去腺Dex大鼠的1.4倍(p<0.05)。蛋白水平的实验得到相似的结果。该实验表明在体低氧上调GILZ的表达需要GC存在,而且低氧和GC能协同上调GILZ的表达。 二、GC能进一步提高低氧时大鼠脾脏HIF-1α蛋白的水平参与低氧反应 最重要的转录因子是低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)。低氧可以明显提高HIF-1α蛋白的稳定性,从而使其在细胞内的浓度升高。我们采用Western blot的方法观察了大鼠在不同处理情况下HIF-1α蛋白水平的变化。 结果表明去腺大鼠低氧暴露后,其脾脏HIF-1α的蛋白水平明显增高。该实验说明我们给予的低氧条件的确可以使大鼠处于低氧状态。而去腺低氧联合Dex组大鼠脾脏的HIF-1α蛋白进一步增多,表明糖皮质激素能进一步增强HIF-1α蛋白在低氧时的稳定性,从而可能增强机体的组织细胞对低氧的适应性。 三、低氧和GC单独或者协同上调RAW264.7细胞GILZ的表达 为了排除在体低氧导致的神经内分泌变化的影响,了解低氧是否可以直接影响GILZ的表达,我们采用了体外培养的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,将细胞放入低氧培养箱(1％O2)内不同时间,检测GILZ的表达情况。结果显示,与对照相比,低氧组GILZ mRNA水平在4h时先轻度降低,之后逐渐增高,12h达到最高,约为对照的2.7倍(p<0.01),24h回落但仍高于对照水平。Western blot结果表明GILZ蛋白表达在低氧处理8h时上调明显,12h仍维持上调水平,表明低氧能够直接上调小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞中GILZ的表达。 在证实Dex能够以时间依赖性的方式上调GILZ mRNA的表达的基础上,进-步观察了细胞分别给予低氧、Dex(100 nM)单独或者联合处理12小时,GILZ的表达情况。结果显示,低氧和Dex可以单独上调GILZ mRNA的表达,而GC和低氧联合处理组GILZ mRNA表达比低氧和Dex单独处理组都要明显的高,蛋白水平的检测结果显示了类似的变化趋势,表明GC和低氧在上调GILZ表达时二者有协同作用。 四、低氧上调GR的表达 上述实验证明低氧不仅单独可以上调GILZ的表达,而且可与Dex联合作用协同上调GILZ的表达。为探讨其机制,我们观察了低氧单独或者联合Dex对GR表达的影响。结果显示,低氧可上调RAW264.7细胞GR mRNA和蛋白的表达。对去腺大鼠的研究表明,去腺后低氧联合Dex处理组脾组织中GRmRNA蛋白质的表达都比假手术组和去腺低氧组明显增高。表明低氧可以通过上调GR从而增强GC诱导GILZ表达的作用。当然由于GILZ启动子上还存在有其他的转录因子反应元件,因此不排除在低氧条件下其他信号转导通路激活的转录因子也参与了对GILZ表达的调节。 五、低氧对炎症因子IL-1β表达的影响 有研究证实GILZ可以通过抑制NF-kB的转录活性从而发挥抑炎的作用,而促炎细胞因子IL-1β是NF-kB的靶基因。因此我们进一步观察了低氧对RAW264.7细胞IL-1β mRNA表达的影响,以探讨低氧上调GILZ与促炎细胞因子生成的关系。结果显示,RAW264.7细胞IL-1β mRNA表达低氧4h增加至对照的1.7倍(p<0.05),之后下降,12h约降至对照的40％(p<0.05)。IL-1mRNA表达变化的趋势与低氧对GILZmRNA的表达调节趋势正好相反,而大鼠低氧处理12h后脾组织IL-1βmRNA表达变化也与GILZ相反,提示低氧上调GILZ表达可能是低氧适应的机制之一,并与GC抑制低氧导致的炎症反应密切相关。当然其确切的关系还需要进一步实验来证明。 综上所述,对大鼠和体外培养的RAW264.7细胞的研究发现：低氧和GC单独都可以上调GILZ mRNA和蛋白的表达,二者共同作用时具有协同效应,该作用与低氧能上调GR的表达有关,Dex还能进一步提高低氧时大鼠脾脏HIF-1α蛋白的水平,从而增强组织细胞对低氧的适应性。初步实验还发现大鼠低氧暴露后GILZ的表达水平与IL-1β mRNA的表达程度呈负相关,推测低氧上调GILZ的表达是低氧适应的机制之一,并与GC抑制低氧导致的炎症反应有关。以上结果为进一步研究低氧调节GILZ表达的机制和生物学意义打下了基础。