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目的有研究发现糖尿病、高血压时均有激肽释放酶-激肽系统(KKS)活性的降低。在体和细胞水平研究均显示,缓激肽(BK)可以通过与激肽BK2受体结合而增加胰岛素所导致的葡萄糖摄取以及胰岛素信号传导的级联反应。我们的前期实验将重组腺相关病毒介导人组织型激肽释放酶基因(rAAV-HK)导入STZ诱导的2型糖尿病大鼠体内,结果发现它可明显改善大鼠的胰岛素抵抗及发挥肾脏保护作用,但其具体机制尚不明确。为了进一步探讨HK防治糖尿病及其并发症的机制及在胰岛素受体和受体下游环节进行糖尿病基因治疗的可能性,本实验在我们原有的工作基础上,在体和细胞水平观察激肽释放酶基因对胰岛素相关信号分子蛋白表达的调节作用,同时对其相关的信号传导通路进行初步的探讨。方法和结果一.在体实验前期实验中48只雄性Wistar大鼠随机分为普通饲料组(16只)和高脂高糖饲料组(32只),高脂高糖饲料组以小剂量STZ加高糖高脂饮食诱导2型糖尿病模型,随机分为2组,分别经尾静脉导入含人类组织型激肽释放酶基因的rAAV-HK(HK组)或含报告基因LacZ的rAAV-lacZ(LacZ组),给药后第12周处死动物,并取心、肝、肾等组织作研究。本实验取前期实验中三组大鼠的心、肝、肾组织Western Blot检测HK蛋白质在各脏器的表达分布情况及胰岛素相关信号分子胰岛素受体(IRβ)、PI3K、Akt的表达及其磷酸化的水平。采用原位末端标记(TUNEL)法检测大鼠肾组织细胞凋亡指数,并用western-blot的方法检测凋亡相关基因bcl-2/bax的表达。结果显示rAAV介导的HK蛋白可在2型糖尿病大鼠的肝脏、肾脏、心脏表达,而且相较于LacZ组其表达增强。Western Blot检测发现,三组总的胰岛素受体(IRβ)、Akt的表达无明显改变而其磷酸化水平P-IRβ、P-AKT及PI3K,相较于正常对照组,LacZ组明显下调,而导入HK基因的HK组明显上调,这可能为胰岛素敏感性增加的原因之一。TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase–mediated nick end labeling assay)染色的结果显示LacZ组肾脏凋亡细胞较同期对照组增多,而HK组凋亡细胞数明显少于LacZ组。并且Western Blot结果表明HK基因可上调抑凋亡基因bcl-2而下调促凋亡基因bax的蛋白表达。二.细胞实验脂肪细胞富含胰岛素受体。用0.5mmol/ L的IBMX、1.0μmol/ L的DEX和2mg/ L的insulin将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞,然后用缓激肽(BK)、BK的2型受体(BKR2)拮抗剂(HOE-140)及MAPK抑制剂(PD98059)、PI3K抑制剂(LY294002)和PKC抑制剂(H7)干预诱导培养的脂肪细胞, Western Blot方法检测BK和HOE-140对胰岛素相关信号转导分子IRβ、AKT、MAPK的磷酸化水平和PI3K蛋白表达水平的影响。Western Blot结果显示:BK刺激脂肪细胞后,细胞IRβ、AKT、MAPK磷酸化水平和PI3K蛋白的表达水平明显上调,而BKR2的抑制剂HOE能够抑制其上调效应。结论重组腺相关病毒载体介导的人类组织型激肽释放酶基因改善胰岛素抵抗及糖尿病大鼠的肾功能的作用机理可能为:(1)HK增加胰岛素信号转导途径中IRβ、Akt蛋白的磷酸化水平和PI3K的蛋白表达(2)BK通过BKR2增加胰岛素信号转导途径中IRβ、Akt、MAPK蛋白的磷酸化水平和PI3K的蛋白表达(3)HK上调肾组织的抑凋亡基因bcl-2而下调促凋亡基因bax的蛋白表达抑制肾脏细胞凋亡。