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研究背景细菌外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMV）是从细菌细胞壁外膜脱落的磷脂双分子层结构的膜性囊泡,它由外膜蛋白、脂多糖、周质蛋白、酶、DNA、毒素等组成,能将这些物质转运给其它细胞,从而介导细胞间通讯。革兰氏阴性菌及少量革兰氏阳性菌均能分泌OMV。有研究表明,当肠道菌群发生紊乱或失衡时,大肠杆菌引发的腹泻、肠出血、肠粘连等消化道疾病,可能与其释放的OMV与肠上皮细胞黏附诱发细胞损伤相关。本课题以大肠杆菌OMV和肠上皮Caco-2细胞为材料,分析大肠杆菌OMV诱导肠上皮Caco-2细胞DNA的损伤。从OMV细胞间通讯的角度,诠释引起消化道疾病的机制,为寻求控制消化道疾病的方法提供一种新的思路。目的1.建立大肠杆菌OMV分离纯化方法。2.比较不同大小大肠杆菌OMV诱导肠上皮Caco-2细胞DNA损伤能力的差异,并分析诱导DNA损伤的可能机制。3.分析大肠杆菌在纯水中的生存能力和可能的机制。方法1.分别采用20,000 x g、50,000 x g两种离心力制备大肠杆菌OMV,粒度仪分析OMV的尺度分布;透射电镜观察OMV的超微结构;BCA蛋白检测法测定OMV的蛋白含量。2.OMV与Caco-2细胞在37℃、5%CO2条件共培养24 h。荧光共聚焦显微镜观察肠上皮Caco-2细胞摄取OMV的情况;Western-blot检测肠上皮Caco-2细胞与OMV作用24h的γ-H2AX蛋白的表达水平;单细胞凝胶电泳检测肠上皮Caco-2细胞与OMV作用24 h的DNA双链断裂损伤的程度。3.收集对数增殖期大肠杆菌制备纯水悬液,于37℃条件下密闭保存。平板活细菌计数结果制定3月内的生存曲线;采用Calcein-AM和PI进行LIVE/DEAD细菌活性检测;透射电镜观察细菌超微结构;Western-blot检测大肠杆菌LexA蛋白的相对表达量;免疫共沉淀检测大肠杆菌RecA-LexA蛋白复合物的相对表达量。结果1.超微结构显示OMV呈大小不等的脂质双分子膜微囊结构。20,000xg和50,000xg所制备的OMV平均粒径分别为217.5±7.29nm、186.3±6.59nm（P<0.05）;20,000xg和50,000xg所制备的OMV蛋白含量分别为（1.88±0.01）x103μg/ml、（2.09±0.09）x103μg/ml（P<0.05）。2.荧光共聚焦显微镜观察发现OMV在24 h几乎全部进入Caco-2细胞。20,000xg OMV、50,000 xg OMV、对照组（不加OMV）Caco-2细胞的γ-H2AX蛋白条带灰度值标准化数据的比值分别为2.23±0.18、1.58±0.20、1±0.30（P<0.05）,彗星尾部DNA含量（Tail DNA%,TDNA%）分别为（72.21±14.61）%、（23.11±4.98）%、（1.02±1.41）%（P<0.05）,相应DNA损伤程度为高度（3级）、中度（2级）、无损伤（0级）。3.大肠杆菌在纯水中培养0、1、2、3月的活细菌数量为（3.85±0.07）x1014、（4.82±3.02）x 107、（1.69±0.55）x 107、（2.61±0.04）x106 CFU/ml,与0月组比较,1、2、3月细菌数量显著降低（P<0.05）;0-3月的LexA蛋白条带灰度值标准化数据分析的比值依次为1±0.08、0.83±0.08、0.73±0.04、0.53±0.06,与0月组比较1-3月组细菌表达LexA具有显著差异,且随着保存时间的延长显著下降（P<0.01,P<0.001）。0月组细菌RecA结合LexA的蛋白和LexA结合RecA的蛋白的相对灰度值分别为73274.4±2191.36、32097±2422.27,1、2、3月组RecA结合LexA（95604.6±10712.48、120245.8±5078.71、129991±2251.07）和LexA结合RecA（51587.6±2288.72、61851.8±3089.31、73558.6±6120.73）的相对灰度值均显著高于0月组（P<0.001,P<0.01,P<0.05）,且与保存时间呈正相关。超微结构显示1、2、3月存活的大肠杆菌有完整的细胞壁,但内部结构相对简单。结论1.OMV诱导肠上皮Caco-2细胞的DNA双链断裂损伤,损伤程度与OMV的大小相关。尺度较大的OMV比尺度较小的OMV诱导肠上皮Caco-2细胞DNA损伤更大。2.大肠杆菌在纯水中的生存与细菌的SOS应答系统有关。