研究背景支气管哮喘（Asthma,Bronchial asthma,简称哮喘）是全球最常见的慢性疾病之一。据不完全统计,全世界目前大约有3亿哮喘患者,且有证据显示目前哮喘患病率以每年1%左右的速度递增,严重影响患者的日常生活,给患者家庭及社会带来了沉重的经济负担,因此对支气管哮喘进行深入的研究具有深远的社会意义。支气管哮喘是由多种炎症细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞等共同参与的慢性气道炎症性疾病。炎症细胞在气道的局部聚集、炎症介质和细胞因子的释放等是形成和维持气道炎症并进而引起组织损伤和气道功能障碍的主要原因,其中T淋巴细胞在哮喘气道炎症中发挥着核心作用。根据T淋巴细胞在免疫应答中的功能不同,将T淋巴细胞分成辅助性T细胞（Th）、细胞毒性T细胞（Tc）和调节性T细胞（Treg）,.其中Th细胞又分为Th1细胞和Th2细胞。既往认为支气管哮喘是由过度激活的Th2细胞介导的气道慢性炎症性疾病,Th1反应被认为是过敏性疾病包括支气管哮喘的保护因素。针对过敏性疾病的免疫疗法可使Th2细胞因子表型转变为Th1细胞因子表型,同时临床症状得到改善。而且倾向产生Th1细胞因子的个体患过敏性疾病的可能性减少。因此哮喘中Th1/Th2失衡理论被广泛接受。但近年来发现,哮喘的一些实验和临床现象并不能完全用Th1/Th2失衡理论来解释;并且有研究发现Th1细胞可以加重过敏症和哮喘,Th1细胞因子IFN-γ,与抗原诱导的气道高反应和嗜酸粒细胞浸润有关。而Treg既能抑制Th1细胞,也能抑制Th2细胞,用Treg细胞可更好的解释哮喘的发病机制,因此近年来成为研究的热点。Th17细胞是近来发现的不同于Th1和Th2的另一种CD4⁺T细胞的新亚型,具有IL-23依赖性产生IL-17的特性,研究发现其与Treg之间存在复杂的相关关系,并且与支气管哮喘也有关。因此既然Th1/Th2细胞亚群比例和功能的失衡是支气管哮喘重要的免疫异常,是哮喘发病机制中的重要环节,那么是否在哮喘中同样也存在Treg/Th17亚群比例和功能的失衡,这个问题值得我们去深入研究。目的1、探讨调节性T细胞（Treg）与Th17细胞及相应转录因子Foxp3、RORγt在支气管哮喘中的失衡表达;2、探讨Treg与Th17细胞及转录因子Foxp3与RORγt表达量的比值与气道炎症的相关关系。方法1、小鼠哮喘模型的建立及评价30只雌性SPF级Balb/c小鼠按随机数字表法分为正常对照组、哮喘组和地塞米松治疗组;哮喘组于第0d、7d、14d（腹腔+皮下）注射0.2ml致敏液（含20ug OVA,20mg AL（OH）₃）,第21-27d雾化吸入5%OVA激发;地塞米松治疗组于21至27d雾化吸入5%OVA激发前30min腹腔注射地塞米松（1mg/Kg）:正常对照组则用生理盐水替代OVA致敏和激发;利用无创小鼠体描仪通过全身性体积描记法观察各组小鼠气道反应性;通过肺组织石蜡切片苏木素-伊红（HE）染色观察各组气道病理改变;用酶联免疫吸附测定法检测小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-5、IFN-γ含量。2、调节T细胞与Th17细胞在支气管哮喘小鼠中的失衡以及与气道炎症的相关性分析用酶联免疫吸附测定法检测各组小鼠血清和支气管肺泡灌洗液中IL-10、IL-17含量;用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定法检测肺组织IL-10mRNA、IL-17 mRNA的表达;通过各组小鼠脾脏制备脾细胞单细胞悬液,利用流式细胞检测技术检测各组CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞和CD4⁺IL-17⁺细胞占CD4⁺细胞的比例。3、转录因子Foxp3/RORγt在支气管哮喘小鼠中失衡表达以及与气道炎症的相关性分析用酶联免疫吸附测定法检测各组小鼠血清和支气管肺泡灌洗液中IL-10、IL-17含量;用逆转录.聚合酶链反应（RT-PCR）测定法检测肺组织IL-10mRNA、IL-17mRNA、Foxp3mRNA和RORytmRNA的表达;用免疫组化及免疫印迹（Western blot）法检测肺组织中Foxp3和RORγt蛋白的表达。结果1、成功建立小鼠哮喘模型。哮喘组所有小鼠在雾化过程中均出现不同程度的烦躁不安或安静少动、呼吸加快加深、点头呼吸、弓背直立、前肢缩抬,二便失禁等哮喘速发相反应表现。同等剂量乙酰胆碱激发（3.125、6.25、12.5、25、50mg/m1）的气道反应性检测中,哮喘组小鼠%ΔPenh明显高于正常对照组。哮喘组小鼠细支气管及伴行血管周围大量炎症细胞浸润,气道壁和肺组织中可见以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主的大量炎症细胞浸润,支气管管壁增厚、管腔狭窄,支气管管腔内可见粘液栓,粘膜皱壁减少,杯状细胞增生,肺泡间隔不同程度增宽,部分断裂,形成肺气肿。哮喘组小鼠肺泡灌洗液中细胞总数及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞计数明显高于正常对照组（P＜0.01）。哮喘组小鼠肺泡灌洗液中IL-5水平明显高于正常对照组（P＜0.01）;与之相反,哮喘组小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ,水平低于正常对照组（P＜0.01）。2、同等剂量乙酰胆碱激发（3.125、6.25、12.5、25、50mg/ml）的气道反应性检测中,哮喘组小鼠%ΔPenh明显高于正常对照组小鼠（P＜0.01）,地塞米松治疗组小鼠%ΔPenh较哮喘组明显降低（P＜0.01）;在乙酰胆碱浓度为3.125、6.25、12.5mg/ml激发时,正常对照组和地塞米松治疗组小鼠%ΔPenh相似,差异无统计学意义（P＞0.05）。在乙酰胆碱浓度为25、50mg/ml激发时,地塞米松治疗组小鼠%ΔPenh高于正常对照组小鼠（P＜0.01）。哮喘组肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞计数均较正常对照组明显增多（P＜0.01）;地塞米松治疗组与哮喘组相比中性粒细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞计数明显减少（P＜0.01）,与正常对照组比较仍较高（P＜0.01）。哮喘组小鼠肺泡灌洗液、血清中IL-17水平较正常对照组明显升高（P＜0.01）;地塞米松治疗组肺泡灌洗液、血清中IL-17水平较哮喘组有所下降,但与正常对照组比较仍较高（P＜0.01）;与之相反,哮喘组小鼠肺泡灌洗液、血清中IL-10水平较正常对照组明显下降（P＜0.01）;地塞米松治疗组肺泡灌洗液、血清中IL-10水平较哮喘组有所升高,但与正常对照组比较仍较低（P＜0.01）。哮喘组小鼠肺组织中细胞因子IL-17mRNA的表达较正常对照组小鼠明显增强（P＜0.01）;地塞米松治疗组小鼠肺组织IL-17mRNA的表达减弱,明显低于哮喘组小鼠（P＜0.01）,但与正常对照组小鼠比较仍较高（P＜0.01）。哮喘组小鼠肺组织中细胞因子IL-10mRNA的表达较正常对照组小鼠明显减弱（P＜0.01）;地塞米松治疗组小鼠肺组织IL-10mRNA的表达较哮喘组小鼠有所增强（P＜0.01）,但与正常对照组小鼠比较仍较低（P＜0.01）。流式细胞仪检测结果显示哮喘组CD4⁺细胞中淋巴细胞亚群CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞百分率显著低于正常对照组（P＜0.01）;地塞米松治疗组CD4⁺细胞中淋巴细胞亚群CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞百分率较哮喘组小鼠有所增加（P＜0.01）,但与正常对照组小鼠比较仍较低（P＜0.01）。哮喘组CD4⁺细胞中淋巴细胞亚群CD4⁺IL+17⁺细胞百分率显著高于正常对照组（P＜0.01）;地塞米松治疗组CD4⁺细胞中淋巴细胞亚群CD4⁺IL-17⁺细胞百分率较哮喘组小鼠有所减少（P＜0.01）,但与正常对照组小鼠比较仍较高（P＜0.01）。哮喘组CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞/CD4⁺IL+17⁺细胞比例较正常对照组下降（P＜0.01）;地塞米松治疗组CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞/CD4⁺IL-17⁺细胞比例较哮喘组小鼠有所增加（P<0.01）,但与正常对照组小鼠比较仍较低（P<0.01）。CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞/CD4⁺IL-17⁺细胞与气道炎性指标经相关性分析显示,CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞/CD4⁺IL-17⁺细胞比值与气道反应性（%△Penh）呈负相关,用3.125、6.25、12.5、25、50mg/ml不同浓度乙酰胆碱激发时,相应的气道反应性（%△Penh）与CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞/CD4⁺IL-17⁺细胞比值的相关系数分别是-0.810,-0.853,-0.796,-0.898,-0.838（P均<0.01）;与嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数呈负相关（r=-0.873,-0.878,-0.855;P均<0.01）;与血清、肺泡灌洗液中IL-10含量呈正相关（r=0.93,0.926;P均<0.01）,而与血清、肺泡灌洗液中IL-17呈负相关（r=-0.878,0.828;P均<0.01）。3、哮喘组小鼠肺组织中转录因子RORγt mRNA的表达较正常对照组小鼠明显增强（P<0.01）;地塞米松治疗组小鼠肺组织RORγt mRNA的表达减弱,明显低于哮喘组小鼠（P<0.01）,但与正常对照组小鼠比较仍较高（P<0.01）。哮喘组小鼠肺组织中转录因子Foxp3 mRNA的表达较正常对照组小鼠明显减弱（P<0.01）;地塞米松治疗组小鼠肺组织Foxp3 mRNA的表达较哮喘组小鼠有所增强（P<0.01）,但与正常对照组小鼠比较仍较低（P<0.01）;Foxp3/RORγt mRNA表达量比值哮喘组（0.18±0.05）较正常对照组（1.97±0.58）明显降低（P<0.01）;地塞米松治疗组Foxp3/RORγt mRNA表达量比值为（0.59±0.14）,与哮喘组Foxp3/RORγt mRNA表达量比值比较有所升高（P<0.01）,但仍低于正常对照组（1.97±0.58）（P<0.01）。免疫组化分析显示哮喘组小鼠转录因子Foxp3表达强度较正常对照组明显减弱,表达范围减少（P<0.01）;转录因子Foxp3在地塞米松治疗组小鼠表达强度与哮喘组小鼠比较有所增高（P<0.01）,与正常对照组比较强度和范围仍降低（P<0.01）。哮喘组小鼠转录因子RORγt表达强度较正常对照组小鼠异常增强,表达范围广泛（P<0.01）;在地塞米松治疗组小鼠转录因子RORγt表达强度和表达范围高于正常对照组小鼠（P<0.01）,与哮喘组小鼠相比,地塞米松治疗组小鼠RORγt表达强度和表达范围降低（P<0.01）。Western blot结果分析显示转录因子Foxp3蛋白在正常对照组小鼠肺组织中有表达,而在哮喘组小鼠肺组织中低表达,两组比较差异有显著性（P＜0.01）;予以地塞米松干预后,Foxp3蛋白在小鼠肺组织中表达增高,高于哮喘组小鼠,但低于正常对照组小鼠（P＜0.01）。转录因子RORγt蛋白在正常对照组小鼠肺组织中有低表达,而在哮喘组小鼠肺组织中异常高表达,两组比较差异有显著性（P＜0.01）;在地塞米松干预治疗后,RORγt蛋白仍表达,低于哮喘组小鼠,但高于正常对照组小鼠（P＜0.01）。哮喘组Foxp3/RORγt蛋白表达量比值明显低于正常对照组（P＜0.01）;地塞米松治疗组Foxp3/RORγt蛋白表达量比值较哮喘组有所升高,但仍低于正常对照组（P＜0.01）。Foxp3/RORγt蛋白表达量的比值与气道炎症性指标作相关性分析,结果显示Foxp3/RORγt蛋白表达量的比值与气道反应性（%ΔPenh）呈负相关,用3.125、6.25、12.5、25、50mg/ml不同浓度乙酰胆碱激发时,相应的气道反应性（%△Penh）与Foxp3/RORγt蛋白表达量比值的相关系数分别是-0.708,-0.715,-0.702,-0.822,-0.846（P＜0.01）;Foxp3/RORγt蛋白表达量比值与嗜酸性粒细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数呈负相关（r＝-0.904,-0.881,-0.862,P＜0.01）,与血清和肺泡灌洗液中IL-17含量呈负相关（r＝-0.880,-0.846,P＜0.01）,而与血清和肺泡灌洗液中IL-10含量呈正相关（r＝0.718,0.816,P＜0.01）。结论1、通过对致敏剂及致敏方法的改进,使我们更容易成功建立小鼠哮喘动物模型,为随后进一步实验研究提供了一个很好的基础;利用无创小鼠体描仪通过全身性体积描记法可方便的观察实验小鼠气道反应性,为进一步研究支气管哮喘的病理生理学机制提供了很好的工具和手段。2、在支气管哮喘中存在Treg与Th17的失衡,表现为CD4⁺细胞中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞减少,CD4⁺IL-17⁺细胞增多,CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞/CD4⁺IL-17⁺细胞比例低下,反映哮喘的免疫失衡;并且CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞/CD4⁺IL-17⁺细胞比例与气道炎症各指标呈直线相关,Treg与Th17的失衡很可能是哮喘气道炎症形成的重要原因之一。3、在支气管哮喘中,转录因子Foxp3/RORγt失衡表达,表现为转录因子Foxp3基因和蛋白的低表达,RORγt基因和蛋白的高表达,F0xp3/RORγt蛋白表达量比值与气道炎症各指标呈直线相关,Foxp3/RORγt的失衡表达很可能是哮喘中Treg与Th17失衡形成的主要机制。4、地塞米松可能通过调节Treg与Th17的平衡来抑制气道炎症。