论文部分内容阅读
目的：明确和证实MSCs在辐射诱导胸腺瘤过程中对肿瘤形成的抑制作用，观察和探讨p53启动子甲基化是否是辐射诱导胸腺瘤形成的主要机制之一，MSCs对p53启动子甲基化的保护是否影响了辐射诱导胸腺瘤的形成。方法：1.辐射诱发C57BL/6鼠胸腺瘤模型制备采用深部X射线治疗机照射，电压200kV，电流10mA，滤板1.0mmAl和0.5mmCu，全身X射线照射，照射剂量1.75Gy/次，照射时间336秒，每周1次，共4次，总剂量7Gy。末次照射6个月后处死对照组、模型组及MSCs治疗组小鼠，取胸腺组织行胸腺病理学观察。2. MSCs抑制辐射诱导小鼠胸腺瘤的发生MSCs的分离及培养：处死乳鼠，行颈椎脱臼法处死后浸泡5min（75%酒精内），无菌取股骨、肱骨，剪除干骺端，反复冲洗骨髓腔，制成单细胞，进行细胞培养。MSCs尾静脉注射治疗模型的建立:收集MSCs，调整MSCs浓度为2.0×106个/ml，取0.5ml经尾静脉注入辐射诱发胸腺瘤模型小鼠；每周1次,共4次。模型组和对照组在同一时间点经尾静脉输注0.5ml的生理盐水作对照。病理学观察治疗组胸腺组织并统计模型组及治疗组胸腺瘤的发生率。3. P53启动子基因序列分析及甲基化检测根据GenBank登陆的C57BL/6小鼠的p53基因启动子序列（登陆号：AF287146.1），应用MethPrimer（http://www.urogene.org/methprimer/index1.html）设计用于甲基化特异PCR引物（MSP）和甲基化测序PCR引物（BSP），基因组提取，亚硫酸盐处理，甲基化PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，进行甲基化引物的检测及甲基化序列分析。结果：1.模型组：胸腺皮髓分界不清，淋巴样肿瘤细胞弥漫性分布，正常淋巴细胞变性坏死，细胞核大，深染。说明辐射诱发了胸腺淋巴瘤的形成。MSCs治疗组可见正常的胸腺组织，少量淋巴细胞核大，深染。根据病理学分析结果判断，模型组小鼠胸腺瘤的发生率是72.73%（8/11），MSCs治疗组小鼠胸腺瘤的发生率是20%（2/10）。2.经亚硫酸盐处理的基因组DNA，应用MSP引物5进行PCR扩增，可见正常对照组、模型组、MSC治疗组均未出现甲基化扩增条带；对MSP引物5PCR扩增片段所在区段序列应用亚硫酸盐测序（BSP）引物7进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示正常对照组、模型组、MSC治疗组均有目的基因出现；3.将PCR产物进行TA克隆，选取阳性克隆进行测序，所测得的PK7、PM7、PZ7序列与预测序列基本一致，表明所测得的序列为p53启动子甲基化序列；将所测得的PK7、 PM7、 PZ7序列应用ClustalW2-Multiple Sequence Alignment（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）与预测的p53启动子甲基化序列对比分析，结果显示，对照组和模型组p53启动子序列中未出现预测的甲基化位点模型组在第1724位出现了胞嘧啶(C)甲基化， MSCs治疗组该位置未出现甲基化。结论：进一步证实MSCs具有保护辐射损伤作用，抑制辐射诱发胸腺瘤的发生；辐射诱发胸腺瘤P53启动子发生异常高甲基化；MSCs治疗组胸腺瘤组织发生DNA甲基化，可能通过异常甲基化保护胸腺组织免受辐射损伤