鼻咽癌细胞microRNA表达谱鉴定及miR-223功能研究

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目的:  鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中国南方及东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一。流行病学调查和病因学研究显示,鼻咽癌的发病具有明显的民族、地域和家族聚集现象,提示该恶性肿瘤可能是一种在某些特定环境的影响下涉及多个基因改变的遗传性疾病。然而,迄今为止,鼻咽癌具体的分子发病机制尚未完全阐明。  微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一种在进化过程中高度保守的、内源性非编码小RNA,主要通过与靶mRNA的3端非翻译区(3-untranslated regions,3-UTRs)结合后诱导靶mRNA降解或阻遏翻译,从而达到转录后抑制特定基因的表达,在诸如细胞增殖、分化和凋亡等多种生物过程中起着基因表达调控的作用。新近的研究表明,miRNA在肿瘤的发生发展中发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用。  本研究拟采用miRNA芯片筛选鼻咽癌细胞与正常鼻咽上皮细胞中表达差异的miRNA,并探讨差异表达的miRNA对鼻咽癌细胞生物学特性的影响,为进一步探索鼻咽癌发病的分子机制及寻找新的基因治疗靶点提供理论依据。  方法:  1.利用miRNA芯片技术分析鼻咽癌细胞CNE1、CNE2和永生化鼻咽上皮细胞NP69中的miRNA表达情况,对鼻咽癌中差异表达的miRNA进行筛查,建立鼻咽癌细胞miRNA的基因表达谱。  2.结合real time RT-PCR技术从中选取表达差异最明显并可能与肿瘤发生发展相关的miR-223作为我们研究的靶点,利用脂质体转染技术研究miR-223高表达对鼻咽癌细胞CNE2生物学特性的影响,内容包括:  (1) CCK-8法检测miR-223高表达对CNE2细胞增殖能力的影响;  (2) Caspase-3法、AnnexinV-FITC/PI检测法和Hoechst33258染色法检测miR-223高表达对CNE2细胞凋亡诱导的作用;  (3)细胞创伤愈合法和Transwell小室法观察miR-223高表达对CNE2细胞迁移、侵袭能力的影响;  (4)平板克隆形成实验及软琼脂克隆形成实验观察miR-223高表达对CNE2细胞克隆形成能力影响。  结果:  1.miRNA芯片结果显示,在鼻咽癌细胞CNE1中,共检测到290个人类miRNAs分子,与永生化鼻咽上皮细胞NP69相比较,表达差异达2倍以上的miRNA分子共有116个,其中91个上调,上调最显著的为miR-150(524.97倍),25个下调,下调最显著的为miR-223(0.0001倍);在鼻咽癌细胞CNE2中,共检测到300个人类miRNAs分子,与永生化鼻咽上皮细胞NP69相比较,表达差异达2倍以上的miRNA分子共有113个,其中89个上调,上调最显著的为miR-150(341.91倍),24个下调,下调最显著的为miR-223(0.0002倍)。  2.Real time RT-PCR检测miR-223在CNE1、CNE2和NP69中的表达显示,miR-223在NP69中表达最高,其次是CNE2,再次为CNE1,结果与芯片结果基本吻合。  3.通过脂质体转染技术,转染miR-223 mimic入CNE2细胞24 h后,miR-223表达增高2474.64倍。  4.通过上调CNE-2细胞的miR-223水平发现,鼻咽癌细胞CNE-2的生长增殖活性减低,凋亡增加,侵袭及迁移能力减弱,克隆形成能力下降。  结论:  鼻咽癌细胞中存在大量异常表达的miRNA分子,这些分子可能通过调节不同靶基因的表达参与了鼻咽癌的发生、发展。与正常鼻咽上皮细胞相比,miR-223在鼻咽癌细胞中表达下调,而通过脂质体转染法在体外过表达鼻咽癌细胞CNE2细胞内的miR-223水平,能显著抑制鼻咽癌细胞CNE2的生长增殖活性,诱导其凋亡,减弱其侵袭及迁移能力,并降低其克隆形成能力,提示了miR-223可能在鼻咽癌的发生、发展中发挥类似抑癌基因的作用。
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