内镜生物膜是引起医院交叉感染的重要原因之一。细菌生物膜(bacterial bio-film, BF)是由细菌及其细菌自身分泌的胞外多聚物基质(extracellular polymeric substance, EPS)所组成,并不可逆的粘附于非生物或生物的表面,它保护细菌免于受环境的影响并增加细菌对杀菌剂的抵抗性。生物膜内细菌的抵抗力较浮游细菌强1000倍。研究发现生物膜的形成能显著降低消毒剂的效果。内镜作为一种侵入性、微创性的诊治工具已广泛应用于临床,但由于其结构复杂、材质多数不耐高温、易腐蚀,给使用后内镜的清洗、消毒、灭菌带来困难,因而更易形成生物膜。研究发现细菌生物膜在消毒后的内窥镜管腔中普遍存在,这在由内镜引起的相关感染中起着重要的作用。细菌生物膜的存在,造成内镜应达到的彻底消毒失败,导致病人之间发生交叉感染,增加了病人的死亡率及医疗费用,成为医院感染潜在的重要影响因素,因此了解内镜生物膜形成的影响因素,寻找控制和清除内镜生物膜的有效方法是值得探讨的问题。本研究旨在通过采用制作内镜管腔材质的聚四氟乙烯管,也称特氟龙(Teflon)管,建立一种密闭式连续循环培养系统,使用大肠埃希菌菌悬液,建立内镜生物膜模型,探讨不同培养时间对内镜生物膜形成的影响,并使用内镜再处理中推荐的清洗剂作用于生物膜,评价不同清洗剂及其不同作用时间对生物膜的清除效果,以指导临床内镜再处理中清洗剂的正确选择及使用,为临床内镜再处理中生物膜的清除提供科学的理论依据,从而更好地控制交叉感染,保证医疗安全,具有重要的临床现实指导意义。而国内尚未见这方面的相关报道。目的建立一种密闭式连续循环培养系统以制备内镜生物膜模型,探讨不同培养时间对内镜生物膜形成的影响；使用内镜再处理中推荐的清洗剂作用于生物膜,评价含酶及非含酶清洗剂及其不同作用时间对内镜生物膜的清除效果,以指导临床内镜再处理中清洗剂的正确选择及使用,为临床内镜再处理中生物膜的清除及《内镜清洗消毒技术操作规范(2004年版)》的修订提供科学的理论依据,对内镜的再处理具有一定的指导意义。方法1.密闭式连续循环培养系统的建立在Vickery所建立的内镜生物膜模型的基础上,将长100cm,直径为4mm的Teflon管、一条返回管、贮液瓶灭菌后,通过贮液瓶橡胶盖上的两个通道(自行设计的橡胶盖上的入口和出口),与蠕动泵连成一个循环通路,从而形成一个密闭式连续循环培养系统。2.内镜生物膜模型的建立将上述建立的密闭式连续循环培养系统置入Excella E24 Incubator shaker series中,取对数生长期的大肠埃希菌加入适量的生理盐水,用比浊仪测试菌液浓度为0.5麦氏单位(1.5×108cfu/mL),加入盛有灭菌营养肉汤的无菌贮液瓶中,将混匀后的无菌贮液瓶中的大肠埃希菌菌悬液和培养基持续灌流于密闭式连续循环培养系统,温度：37℃,由Excella E24 Incubator shaker series维持,速度：80-90mL/h,由蠕动泵维持,每24h更换培养基和大肠埃希菌菌悬液,持续灌流10d,以期在Teflon管腔内表面形成生物膜。每次建模, Teflon管在Excella E24 Incubator shaker series中以同样的方式盘放,以排除由于其位置的不同导致菌液流动的非均衡性对生物膜形成的影响。每次建模,不同培养时间灌流结束后,取出Teflon管,排空管腔内的灌流液,用浸有75%酒精的无菌湿纱布擦拭Teflon管的外表面,再用浸有灭菌PBS的无菌湿纱布擦拭,弃去远端10cm,用无菌手术刀片2cm为标记分段切开,参照文献,放入盛有25mL灭菌PBS的无菌容器中进行冲洗,轻轻翻转容器5次,弃去PBS,用无菌吸管吸去残余的溶液,重复冲洗3次后取出,用无菌纱布吸干多余的液体,洗掉浮游菌。3.生物膜活菌计数为了收集第5、7、10 d不同培养时间Teflon管腔内表面的生物膜细菌,不同培养时间灌流结束后,每组取5段洗掉浮游菌的生物膜测试管,用无菌手术刀片纵向切开,每段管腔的内表面用一个2mm宽的消毒小木棒进行擦刮,然后将其与擦刮棒一起放入盛有5 mL灭菌的PBS的试管中,浸没在超声水浴中震荡10min(42-47KH、20℃)后,再漩涡震荡2 min。每个试管溶液在PBS中做系列10倍稀释,选择适宜稀释度,分别取1 mL稀释液加入无菌平皿中,并倾注冷却至45℃的M-H琼脂20mL,37℃培养24 h,观察菌落生长情况,作细菌计数。菌落计数换算为标准菌落计数单位。4.生物膜表面微结构扫描电镜观察建模后每组取1段洗掉浮游菌的生物膜测试管置于2.5%戊二醛溶液中4℃固定2h,以pH为7.2的磷酸盐缓冲液冲洗3次,每次10min,再以丙酮梯度脱水,每次10min,醋酸异戊酯置换,CO2临界点干燥,离子喷金镀膜,通过SEM进行观察。5.不同清洗剂对内镜生物膜的干预采用上述方法进行建模,持续灌流10d取样,对每2cm做一标记的Teflon管的每段进行编号,排空管腔内的灌流液,用浸有75%酒精的无菌湿纱布擦拭Teflon管的外表面,再用浸有灭菌PBS的无菌湿纱布擦拭,弃去远端10cm,用无菌手术刀片2cm为标记分段切开,共60段标本,参照文献,洗掉浮游菌,采用随机数字表进行完全随机化分组,随机分为空白对照组、含酶清洗剂(Rapidmulti-enzyme cleaner 1:400、Scopezime 1:270)组及非含酶清洗剂(Intercept 1:385)组,上述浓度均为厂家推荐的使用浓度,每种清洗剂组各分为3、5、7min实验组,共10组,其中每个实验组随机取6段覆盖有生物膜的测试管分别单独浸没于10mL三种不同的清洗剂中,在室温下作用3、5、7 min后,取出测试管,用无菌PBS溶液洗去残余的清洗剂,然后使用无菌纱布擦干,其中每组5段用于建模后及不同清洗剂不同时间处理后生物膜内活菌计数测试,1段用于生物膜表面微结构的扫描电镜观察,方法同上。空白对照组即建模成功后洗掉浮游菌的生物膜测试管；实验组即不同清洗剂不同作用时间处理的生物膜测试管。上述实验重复3次。每次实验的标本都是在同一次建模的同一条Teflon管上截取的。结果3次建模测定的第5、7、10d的生物膜细菌平均标准菌落计数(lgCFU/cm2)分别为4.98±0.47、4.82±0.46、4.43±0.52,三组间比较总体有显著性差异(P<0.05),第5d、第7d两两比较无统计学差异(P>0.05),两者分别与第10d比较均有统计学差异(P<0.05)。通过扫描电镜观察,持续灌流5d的Teflon管腔内表面,细菌紧密黏附,生物膜细菌间粘丝样胞外基质形成并交联呈网状；灌流7 d,细菌胞外多聚物基质黏附单个细胞形成微生物菌落；灌流10d则形成稳定成熟的生物膜。空白对照组及同种清洗剂作用不同时间后,测定的残留的生物膜细菌平均标准菌落计数(lgCFU/cm2)分别为5.44±0.19,Rapidmulti-enzyme cleaner: 4.61±0.52, Scopezime:4.67±0.49, Intercept:1.29±0.13。不同清洗分别作用相同的时间3、5、7 min后测定的残留的生物膜细菌平均标准菌落计数(lgCFU/cm2)分别为3.53±1.65,3.52±1.65,3.52±1.65。方差分析显示,不同处理因素(清洗剂)之间有统计学差异(P<0.001)；而不同时间(3、5、7min)之间无统计学差异(P>0.05)。固定时间因素,各组多重比较显示,两种含酶清洗剂Rapidmulti-enzyme cleane组和Scopezime组作用后残留的生物膜细菌分别与非含酶清洗剂Intercept组两两比较均有显著性差异(P<0.001)；而两种含酶清洗剂组作用后残留的生物膜细菌两两比较无显著性差异(P>0.05)。各干预因素和时间之间无交互作用(P>0.05)。由于不同时间之间无显著性差异,因此分别选择不同清洗剂作用时间较短的3 min实验组与空白对照组进行比较,四组间比较总体有显著性差异(P<0.001),三种清洗剂Rapidmulti-enzyme cleaner、Scopezime、Intercept组作用后残留的生物膜细菌分别与空白对照组两两比较均有统计学差异(P<0.001)。扫描电镜观察,不同清洗剂分别作用于生物膜3、5、7min后,含酶清洗剂处理组所残留的生物膜明显多于非含酶清洗剂处理组,而同种清洗剂不同时间处理后无明显差异。结论Teflon管腔内表面生物膜的形成与培养时间有密切关系,随着培养时间的延长,生物膜内的细菌量逐渐减少,形成了成熟稳定的生物膜。两种含酶清洗剂作用后残留在Teflon管腔内表面的生物膜细菌及生物膜明显多于非含酶清洗剂；同种清洗剂不同时间作用后残留的生物膜细菌及生物膜无明显差异,两种含酶清洗剂分别减少了不到1个对数级的细菌,在一定程度上清除了生物膜细菌间胞外基质；而非含酶清洗剂减少了超过4个对数级的细菌,Teflon管内表面上的生物膜细菌几乎都被清除,明显地减少了生物膜细菌及细菌间胞外基质。