长链非编码RNA CCAT1对卵巢癌细胞增殖、侵袭的作用及机制研究

来源 :天津医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yudanlei198
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目的:通过检测lncRNA CCAT1(结肠癌相关转录因子-1)在上皮性卵巢癌组织及细胞中的表达情况,及CCAT1在卵巢癌细胞中的生物学功能作用,初步探讨CCAT1对于卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移的调控作用机制,为卵巢癌的临床诊断及治疗提供理论基础和依据。方法:第一部分:研究lncRNA CCAT1在上皮性卵巢癌组织及细胞中的表达水平及其与临床病理特征的关系:1)收集于天津医科大学第二医院妇科行手术切除的上皮性卵巢癌组织标本及正常卵巢组织标本各40例,应用qRT-PCR法检测CCAT1在上皮性卵巢癌组织及正常卵巢组织中的表达情况,按照卵巢癌中CCAT1的平均表达水平,将≥2.5倍正常卵巢组织表达水平定义为高表达,<2.5倍定义为低表达,并分析其结果与患者临床及病理特征的相关性。2)培养A2780、SKOV3、HO8910及ES-2卵巢癌细胞系,利用Realtime PCR检测lncRNA CCAT1在各细胞系中的表达情况,筛选出表达量最高的细胞系。第二部分:确定CCAT1对于卵巢癌细胞生物学功能的影响。筛选出CCAT1表达水平最高的细胞系后,应用siRNA干扰技术靶向沉默细胞系中CCAT1的表达,设计能特异性抑制CCAT1表达的3条siRNA片段,qRT-PCR法检测各组转染siRNAs后CCAT1的表达水平,并筛选出抑制效果最好的siRNA;应用CCK8检测细胞的增殖情况;平板克隆形成实验检测CCAT1表达下调对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响;应用Transwell检测si-CCAT1及其阴性对照细胞的迁移和侵袭能力;流式细胞术检测si-CCAT 1及其阴性对照细胞的凋亡水平。第三部分:初步探讨CCAT1对于卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移的调控作用机制:通过qRT-PCR及Westernblot法检测CCAT1 siRNA敲低后,细胞增殖、侵袭、迁移等相关基因(let-7,miR-218-5p,Bmi1,c-myc,E-cadherin,N-cadherin)的表达情况。结果:第一部分:lncRNA CCAT1在上皮性卵巢癌组织中的表达水平显著升高,并与患者临床病理特征具有明显的相关性,其高表达与卵巢癌FIGO分期、组织学分级及远处转移呈正相关。lncRNA CCAT1在卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、HO8910及ES-2中表达升高,且在SKOV3中表达水平最高。第二部分:成功构建3条CCAT1-siRNAs后分别转染SKOV3细胞系,筛选出下调效果最佳的si-RNA;CCK8及平板克隆实验证实si-RNA下调了CCAT1的表达后,SKOV3细胞增殖及克隆能力降低;Transwell实验证实si-RNA下调了CCAT1的表达后,SKOV3细胞迁移及侵袭能力下降;流式细胞术证实CCAT1抑制SKOV3细胞的凋亡。上述结果表明,CCAT1可以抑制卵巢癌细胞的凋亡,并增加卵巢癌细胞的增殖及侵袭能力。第三部分:qRT-PCR结果显示,与阴性对照组相比,si-CCAT1组let-7及miRNA-218-5p表达水平明显升高;并且qRT-PCR及Westernblot结果均表明,si-CCAT1组c-myc及Bim1表达水平明显降低,E-cadherin水平升高而N-cadherin水平显著降低(P均<0.05)。结论:本课题显示,lncRNA CCAT1在上皮性卵巢癌组织及细胞系中表达升高,并与患者的临床病理特征具有明确的相关性;CCAT1可促进卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭,并抑制卵巢癌细胞的凋亡;其机制可能是通过抑制let-7、miR-218-5p的表达,上调c-myc与Bim1,以及调节E-cadherin和N-cadherin水平,促进EMT的发生而发挥作用。继续深入研究CCAT1在卵巢癌中的调节机制,将有助于阐明卵巢癌的发病机制,为诊断及治疗卵巢癌提供新的标记物与靶点。
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