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研究背景神经病理性疼痛是指由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛,主要以痛觉过敏、感觉异常、自发性疼痛等为特征。全世界约有3%的人正在遭受神经病理性疼痛的困扰,然而由于目前人们对神经病理性疼痛发病机制的认知仍然有限,且缺乏有效的治疗手段,往往导致患者的病情得不到缓解,因此完善对神经病理性疼痛的发病机制的认知并探索有效的治疗措施,一直是疼痛研究领域函待解决的难题。表观遗传学是指基于非基因序列改变所导致的基因表达水平变化,即通过DNA甲基化、组蛋白乙酰化和非编码RNA控制等方式对基因进行调控。p300是一个具有组蛋白乙酰转移酶活性的转录辅激活因子,在哺乳动物神经系统内有丰富的表达。目前的研究证实,p300与神经细胞的激活有关,它可以通过表观遗传学机制介导大量下游基因的转录。通过干预p300进而调控下游疼痛基因的转录很可能成为治疗神经病理性疼痛的一个新途径。研究目的构建大鼠慢性坐骨神经结扎(chronic constriction injury, CCI)模型,通过观察各组大鼠的疼痛行为学改变,组蛋白乙酰转移酶p300在脊髓水平的动态变化以及在各类神经细胞中的定位,探索p300在神经病理性疼痛中的潜在作用；采用特异性的小发卡RNA (specific small hairpin RNA, shRNA)下调p300的表达和小分子抑制剂C646化学抑制p300的转移酶活性,观察CCI大鼠的疼痛行为学改变,并检测下游疼痛相关因子环氧化酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)的表达水平变化,探索p300参与神经病理性疼痛的潜在表观遗传学调控机制。研究方法1.将雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠随机分为正常组(naive组)、假手术组(sham组)和CCI组。测量各组大鼠的热痛阈和机械性痛阈基础值后,按照Bennett和Xie的方法建立大鼠左侧CCI神经病理性疼痛模型,sham组仅暴露坐骨神经不行结扎。分别在术后第3、7、14、21天对各组大鼠行热痛阈、机械痛阈检测并取大鼠脊髓腰膨大部分保存,分别检测p300的蛋白表达水平,在脊髓背角的形态表达变化和在各类神经细胞中的定位,探索其在神经病理性疼痛当中的潜在作用。2.为了研究抑制p300后能否减轻神经病理性疼痛,鞘内置管成功的大鼠被随机分为4组：假手术+生理盐水组、CCI+生理盐水组、CCI+慢病毒甾体阴性对照组(lentiviral vectors encoding small interfering RNA as the negative control, LV-NC)、CCI+’慢病毒甾体组(lentiviral vectors encoding small interfering RNA of p300gene, LV-shp300)。分别于CCI术后第7天鞘内注射生理盐水,生理盐水,LV-NC和LV-shp30010μ1。同时在CCI术前,术后第3、5、7、10、12、14天测定各组大鼠的热痛阂值和机械痛阈值,于术后第14天处死大鼠取脊髓腰膨大部分行慢病毒甾体转染效率检测、p300和COX-2的表达水平检测,p300和COX-2相互作用的检测等。3.选取鞘内置管成功的大鼠随机分为3组：CCI+二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)组、CCI+C37(646的类似对照物)组、CCI+646组。分别于CCI术后第7天起开始鞘内注射10%DMSO,C37和C646(溶于10%DMSO)10μl。同时在CCI术前,术后第3、5、7、10、12、14天测定各组大鼠的热痛阈值和机械痛阈值,于术后第14天处死大鼠取脊髓腰膨大部分行p300和COX-2的表达水平检测,p300和COX-2相互作用的检测等,进一步探索p300的乙酰转移酶活性对神经病理性疼痛的影响。研究结果1.正常组、sham组和CCI组大鼠术前基础热痛阈值和机械性痛阈值无明显统计学意义(P>0.05)。术后第3天,CCI组的热痛阈和机械痛阈值较sham组和正常组明显下调(P<0.05),术后第7天趋于稳定状态(P<0.05),一直持续至术后第21天(P<0.05)。western blot检测结果表明p300脊髓表达水平从CCI术后第3天起至术后第21天都明显升高(P<0.05vs.正常组和sham组),其中CCI术后第14天达到最高值。免疫组化检测示p300阳性细胞主要表达在灰质,在脊髓背角Ⅰ-Ⅲ层表达较致密；阳性颗粒主要位于细胞核,可见少量也位于细胞浆。在各组的表达趋势类似于前面的western blot结果。免疫荧光双标表明p300阳性细胞主要定位于神经元,在胶质细胞和小胶质细胞未见明显表达。2.在CCI术后第7天鞘内给予慢病毒甾体LV-shp300后,LV-shp300组大鼠在给药后第3天热痛阈值和机械性痛阈值相比LV-NC组和CCI+生理盐水组有所缓解,在给药后第5天和第7天疼痛行为学显著减轻(P<0.05)。p300和COX-2的mRNA、蛋白和组织表达水平检测显示CCI+生理盐水组和LV-NC组相比假手术+生理盐水组,p300和COX-2的表达水平明显升高(P<0.05),而LV-shp300组相比CCI+生理盐水组和LV-NC组明显下调(P<0.05)。ChIP表明CCI+生理盐水组和LV-NC组相比假手术+生理盐水组p300在COX-2基因启动子区招募增加(P<0.05),而经LV-shp300抑制表达后,p300在COX-2基因启动子区招募水平明显下降(P<0.05)。p300和COX-2免疫荧光双标结果表明它们的阳性颗粒都共存于神经元,进一步证明它们之间的相互作用。HE染色表明鞘内给予慢病毒甾体对大鼠脊髓组织无明显损伤。3.在CCI术后第7天鞘内给予p300乙酰转移酶抑制剂C646后,C646组大鼠在给药后第3天热痛阈值和机械性痛阈值有所缓解(P<0.05vs. DMSO组和C37组),在给药后第5天和第7天疼痛行为学显著减轻(P<0.05)。COX-2的mRNA、蛋白和组织表达水平检测显示C646组相比DMSO组和C37组,COX-2的表达水平明显受到抑制(P<0.05)。ChIP表明C646组相比DMSO组和C37组p300在COX-2基因启动子区招募减少(P<0.05)。HE染色表明鞘内给予C646或C37对大鼠脊髓组织无明显损伤。结论1.p300主要在神经元内表达,神经病理性疼痛大鼠脊髓p300表达增加。2.鞘内注射LV-shp300可以缓解CCI诱导的疼痛行为学改变,调控并降低下游神经病理性疼痛相关因子COX-2的表达,提示脊髓p300可能通过上调COX-2基因参与神经病理性疼痛的发病机制。3.鞘内注射p300乙酰转移酶特异性抑制剂C646可以缓解CCI诱导的疼痛行为学改变,调控并降低下游神经病理性疼痛相关因子COX-2的表达,提示p300的乙酰转移酶表观遗传学调控在其所参与的大鼠神经病理性疼痛发病机制中发挥重要作用。4.采用p300的乙酰转移酶抑制剂有望成为治疗神经病理性疼痛的潜在药物。