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鼠李糖脂（Rhamnolipid）生物表面活性剂主要通过铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）发酵法生产获得,但是铜绿假单胞菌较强的条件致病性限制了其在工业中的应用。利用基因工程手段构建一株相对安全且高效的鼠李糖脂生产菌株,是目前该领域研究的重点。本研究利用假单胞菌的重组酶系统敲除防御假单胞菌Pf-5（Pse-udomonas protegens Pf-5）的羟基脂肪酸合成编码基因pha,从而消除鼠李糖脂合成的竞争性抑制作用,增加鼠李糖脂产量。与此同时,通过两亲本接合转移的方法整合来源于P.aeruginosa PAO1的鼠李糖基转移酶基因（Rhamnosyltransferase gene,rhlAB）于Pf-5基因组中。本研究利用Red/ET DNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因的表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰,将3种不同强度组成型启动子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替换了P.aeruginosa PAO1中的PRhlAB原始启动子,构建了表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB,p-BBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB,并将这些表达载体分别在P.protegens Pf-5中异源表达,实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。在LB培养基中摇瓶发酵至42 h时,Pf-5/pBBR1-genta-RhlA B的鼠李糖脂产量为17.56 mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB的鼠李糖脂产量分别是11.135 mg/L,441.135 mg/L,557.764 mg/L,启动子优化后鼠李糖脂产量分别是原始启动子的0.63,25.12和31.76倍。进一步对工程菌株进行培养基优化,以1%的葡萄糖为碳源的LB培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,Pf-5/pB-BR1-kan-PrhaB-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为18.778 mg/L,38.859mg/L,375.742 mg/L,418.551 mg/L。在以橄榄油为碳源的LB培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,Pf-5/pBB-R1-kan-PrhaB-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为30.208 mg/L,55.011 mg/L,937.887 mg/L,844.517 mg/L。以1%的橄榄油为碳源的PG培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为403.27 mg/L,522.034 mg/L。以1%的橄榄油为碳源的MSP培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为410.022 mg/L,586.079 mg/L。获得了最优生产鼠李糖脂工程菌Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,鼠李糖脂产量达到937.887 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物。并通过实时荧光定量PCR定量分析rhlAB基因,在Papra,Ptac和PrhaB启动子调控下,rhlAB基因的相对表达量分别是原始启动子调控下的0.93,2.16和2.77倍。本研究首次在防御假单胞菌Pf-5中对rhlAB基因进行了调控功能研究,利用定向遗传改造的方法成功构建了鼠李糖脂高产菌株,为实现鼠李糖脂rhlAB基因异源高效表达和合成调控奠定了相关基础。