伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）是疱疹病毒科（Herpesviridae）、α-疱疹病毒亚科（Alpha-herpesviridae）的成员,可使猪、牛、羊等多种家畜及野生动物感染发病,其中猪感染后可引起新生仔猪的大量死亡、母猪繁殖障碍及育肥猪的呼吸系统疾病等,对猪群的危害巨大。我国从上世纪90年代开始陆续在规模化猪场广泛使用PRV基因缺失疫苗,并取得了良好的防控效果。但从2011年末开始,在一些已免疫过伪狂犬病疫苗的猪场又陆续爆发了新疫情。对PRV流行毒株的研究表明,现有Bartha株疫苗已不能对猪群提供完全保护,因此,有必要研制针对PRV流行毒株的基因缺失疫苗,以控制当前伪狂犬病的流行。本研究拟以前期分离到的PRV流行毒株AH株为亲本毒株和已构建好的转移载体,采用同源重组方法构建PRV AH gI^-/gE^-基因缺失突变株,并将其制备成灭活疫苗,检测其对小鼠的免疫保护效力。具体研究内容如下:1.基因缺失突变株PRV AH g I^-/gE^-的获得将已构建的转移载体pMD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞,然后接种PRV AH株,使质粒与病毒基因组在细胞内发生同源重组,通过蚀斑纯化法进行筛选,获得缺失gI、gE基因,同时携带EGFP荧光标记基因的重组病毒rPRV-AH-gI^-/gE^-/EGFP⁺;为了去除重组病毒中的EGFP基因,将转移载体pMD-LA-RA与重组病毒rPRV-AH-gI^-/gE^-/EGFP⁺按照上述方法,在BHK-21细胞上进行同源重组,用优化改进后的蚀斑纯化方法进行筛选,最终获得gI、gE基因缺失的突变株PRV AH gI^-/gE^-。通过对小鼠的致病性试验,测定了该基因缺失株的LD₅₀为10^4.3TCID₅₀。2.基因缺失株PRV AH g I^-/gE^-灭活疫苗免疫效力的评价将PRV AH gI^-/gE^-基因缺失株经β-丙内酯灭活后,与Montanide Gel按9:1比例混合制备成灭活疫苗,以10^5.0TCID₅₀、10^6.0TCID₅₀分别免疫小鼠2次,间隔4周,免疫后不同时间采血,检测血清中和抗体水平,二免后4周用100LD₅₀ PRV AH株和经典毒株对免疫小鼠进行攻毒。结果表明,10^5.0TCID₅₀、10^6.0TCID₅₀ PRV AH g I^-/gE^-免疫组血清中和抗体水平最高可达8.96±4.35、19.13±13.08,其中10^6.0TCID₅₀免疫组对PRV AH株和经典毒株的攻毒保护率均为100%（8/8）,能完全抵抗PRV AH株和经典毒株的攻击。本研究以PRV AH流行株为亲本株,采用同源重组技术成功获得了gI/gE基因缺失突变株PRV AH g I^-/gE^-,并将其制成灭活疫苗。动物实验结果表明,PRVAHgI^-/gE^-具有良好的免疫原性,且对PRV经典毒株和流行毒株均有良好的免疫保护效果,有望作为一种新的疫苗候选毒株用于PRV流行株的防控。