双光子荧光显微成像(2PM)因其具有高分辨率,较深的成像深度,漂白区域较小等优点,一直以来都是研究生物组织结构的重要途径,常用于非侵入性研究。随着双光子荧光显微成像研究不断深入,该技术已逐渐在生命科学领域中发挥出重要作用。本文从理论和实验两方面开展对双光子荧光显微成像的研究,对Rhodamine B及由Rhodamine标记的鬼笔环肽与Caski细胞特异性结合物进行成像,验证双光子荧光成像的优势,突出其应用价值。本文中的双光子快速显微成像系统以Micra-5激光振荡器作为光源,Olympus IX71研究级倒置显微镜作为成像单元,二维振镜作为扫描单元,通过LabVIEW软件设计扫描程序进行显微成像,其成像速度可达到1 frame/s。对Rhodamine B样本进行二维成像分析与三维断层采集,验证了显微成像纵向分辨率可达到3.0μm,并得出其三维重构图;对Rhodamine标记的鬼笔环肽与Caski细胞特异性结合物进行成像分析,验证了该系统成像分辨率可达到1.05μm。。理论上根据双光子吸收性质,推导出双光子荧光强度的表达式,由此得到在相同功率情况下45fs的飞秒激光器激发出的荧光光强相对于连续激光器而言,其强度倍数为105数量级,验证了应用飞秒激光的优势。此外,本文对双光子荧光在分辨率方面的优势进行定量阐述。计算了双光子饱和效应,推导了高斯脉冲在样品中垂轴和沿轴的空间分布,并与单光子荧光进行比较。从衍射极限理论出发,得到双光子横向与纵向的理论分辨率公式,通过Relay光路计算出的扫描范围得出本课题中理想聚焦时的实际分辨率公式。软件方面,应用LabVIEW软件设计双光子荧光显微成像控制程序,其核心思想为实现PMT采集和振镜扫描的同步应用顺序结构,分为程序初始化,输出信号波形生成,同步准备,开始运行,采集数据,Z轴移动及任务强制停止七部分。本文对其整体设计思路,程序框架及重要部分进行了详述。实验证实该程序可准确有效地对样品进行二维成像质量分析与三维断层采集,且可以成像起始时间命名存储成像的原始数据。实验上设计并搭建双光子荧光快速显微成像系统。该系统可同时满足高光谱CARS成像和双光子荧光显微成像,利用棱镜对实现脉冲整形,显微成像的横向分辨率可达到1.05μm,纵向分辨率可达到3.0μm。通过振镜进行样本扫描,大大提高了成像速度,对于100×100像素成像,其扫描速度可达到1frame/s,弥补了机械平移台扫描时间过长,对细胞损伤过大的缺陷。以Rhodamine B为样本进行实验,分析了Z轴位置、扫描时间、电压大小脉冲整形等因素对成像分辨率的影响;对Rhodamine B样本进行断层扫描,验证了垂轴分辨率可达到3.0μm的指标,并应用Matlab程序进行三维重构以直观地观察样本的三维立体结构。以Rhodamine标记的鬼笔环肽与Caski细胞特异性结合物为样本,通过该系统观察其荧光成像,可从而显现出细胞分布特点。在不同功率和不同Z轴位置条件下对染色后的细胞进行成像,证明了功率强度越高,位置越趋近于焦平面,其成像质量越高。通过对细胞膜处亮线进行采点可得出细胞成像的分辨率可达1.05μm。通过对细胞显微成像,观察了Caski细胞的微丝结构,验证了鬼笔环肽与细胞特异性结合的能力。