目的:探讨何首乌饮抑制生精细胞凋亡的Cytc/Apaf-1/Caspase9/Caspase3通路作用机制。方法:1.运用组合酶法以及差异贴壁法分离、纯化培养细胞,采用苏丹IV染色法鉴定支持细胞,通过检测α6-integrin和β1-integrin鉴定精原干细胞,运用HE染色法和碱性磷酸酶染色法对生精细胞进行鉴定。2.运用自由基氧化损伤方法建立生精细胞衰老模型,检测SA-β-gal活性来鉴定生精细胞衰老模型是否成功建立,采用流式技术检测各组生精细胞的凋亡情况。3.运用免疫荧光技术检测Cy3表达,筛选si RNA最佳转染时间。运用Western blot技术和RT-q PCR技术检测3段不同序列si RNA干扰后生精细胞中Apaf-1表达水平,从中筛选最佳干扰序列。依据实验目的分为正常对照组、衰老组、NC-si RNA转染组、何首乌饮组、Apaf-1-si RNA干扰组、共孵育组(何首乌饮+Apaf-1-si RNA)。4.运用Western blot技术、免疫荧光技术、RT-q PCR技术分别检测线粒体信号传导通路关键基因Cytc、Caspase9、Caspase3的表达。5.检测各实验组生精细胞的线粒体膜电位。结果:1.苏丹IV染色结果显示支持细胞纯度达到90%。2.衰老组SA-β-gal活性高于正常组,何首乌饮干预后现象逆转,表明生精细胞衰老模型成功建立。生精细胞凋亡检测趋势与其一致。3.Apaf-1-si RNA筛选Western blot技术和RT-q PCR检测结果显示si RNA3干扰组Apaf-1 m RNA和蛋白表达量低于其余干扰组(P<0.05),因此确认si RNA3为最佳干扰序列。4.何首乌饮对Cytc、Caspase9、Caspase3调控作用各组细胞Cyt-c表达水平:Western blot检测蛋白表达水平:衰老组蛋白表达高于正常对照组(P<0.05),何首乌饮组和共孵育组蛋白表达低于衰老组(P<0.05)。NC-si RNA转染组、Apaf-1-si RNA干扰组与衰老组比较均没有统计学意义(P>0.05)。与Apaf-1-si RNA干扰组比较,何首乌饮组和共孵育组蛋白表达降低(P<0.05)。何首乌饮组与共孵育组相比较无统计学意义(P>0.05),其表达趋势与免疫荧光技术检测趋势一致。RT-q PCR技术检测m RNA表达水平:衰老组m RNA表达高于正常对照组(P<0.05)。何首乌饮组和共孵育组m RNA表达低于衰老组(P<0.05)。NC-si RNA转染组、Apaf-1-si RNA干扰组与衰老组相比较均无统计学意义(P>0.05)。与Apaf-1-si RNA干扰组比较,何首乌饮组和共孵育组表达降低(P<0.05)。何首乌饮组与共孵育组比较无统计学意义(P>0.05)。各组细胞Caspase9、Caspase3表达水平Western blot检测蛋白表达水平:衰老组Caspase9、Caspase3蛋白表达高于正常对照组(P<0.05)。NC-si RNA转染组与衰老组Caspase9、Caspase3蛋白表达无统计学意义(P>0.05)。何首乌饮组,Apaf-1-si RNA干扰组及共孵育组Caspase9、Caspase3表达低于衰老组(P<0.05)。与Apaf-1-si RNA干扰组比较,共孵育组Caspase9、Caspase3蛋白表达降低(P<0.05),何首乌饮组与Apaf-1-si RNA干扰组Caspase9、Caspase3蛋白表达无统计学意义(P>0.05),免疫荧光技术检测所得结果与其一致。RT-q PCR检测m RNA表达水平:衰老组Caspase9、Caspase3 m RNA表达高于正常对照组(P<0.05)。NC-si RNA转染组与衰老组Caspase9、Caspase3表达水平比较无统计学意义(P>0.05)。何首乌饮组,Apaf-1-si RNA干扰组和共孵育组Caspase9、Caspase3 m RNA表达低于衰老组(P<0.05)。与Apaf-1-si RNA干扰组比较,共孵育组Caspase9、Caspase3 m RNA表达水平降低(P<0.05)。何首乌饮组与Apaf-1-si RNA干扰组Caspase9、Caspase3 m RNA表达量无统计学意义(P>0.05)。5.线粒体膜电位检测结果与正常对照组比较,衰老组线粒体膜电位降低(P<0.05)。与衰老组比较,何首乌饮组和共孵育组膜电位升高(P<0.05)。NC-si RNA转染组、Apaf-1-si RNA干扰组与衰老组比较均无统计学意义(P>0.05)。与Apaf-1-si RNA干扰组比较,共孵育组和何首乌饮组线粒体膜电位上调(P<0.05)。结论:何首乌饮可通过Cytc/Apaf-1/Caspase9/Caspase3途径抑制生精细胞凋亡。