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1、背景和目的：脑在缺血一定时间并恢复血液灌流后,损伤出现加重的矛盾现象,称为脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury, CI/R)。脑缺血/再灌注损伤涉及多种机制,氧化应激是其中重要机制之一。氧化应激是指机体活性氧(ROS)产生过多和/或抗氧化能力降低,使得ROS在细胞内大量蓄积而引起的组织细胞氧化损伤过程。机体内生成ROS的酶系很多,而NADPH氧化酶(NOX)来源的ROS在心血管系统疾病中的作用最受关注。脑缺血/再灌注损伤时,NOX的活性和表达会有显著升高,伴随ROS水平上升和脑组织损伤。目前虽然有文献报道NOX来源的ROS在脑缺血/再灌注氧化损伤中发挥重要作用,但对NOX各亚型表达情况尚缺乏系统全面的研究,对脑缺血/再灌注时NOX表达变化机制则知之甚少。非肌肉型肌球蛋白轻链(non-muscle myosin light chain, MLC20)是非肌肉型肌球蛋白Ⅱ的组成部分,MLC20的磷酸化水平受肌球蛋白轻链激酶(MLCK)调节。MLC20磷酸化水平的改变涉及到多种疾病(包括脑卒中)的发生发展。有研究表明MLC20磷酸化水平升高可能与脑缺血损伤密切相关,但机制不详。已有文献报道,人肺内皮细胞的MLCK通过磷酸化MLC20调节NOX的激活和ROS的产生,如前所述,NOX在介导脑缺血／再灌注氧化损伤中发挥重要作用,我们的预实验也证实了这一点,这一现象是否与MLC20磷酸化水平变化有关?基于文献报道和预实验结果,我们推测脑缺血/再灌注时MLC20可能通过其蛋白磷酸化水平变化参与了NOX活性和/或表达调节。2、方法：采用脑中动脉阻断(MCAO)法构建大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,雄性SD大鼠(250-300g)70只,随机分为7组,每组10只：①正常对照组(Control组)；②假手术组(Sham组)；③脑缺血再灌注组(CI/R组)；④MLCK特异性抑制剂ML-7+脑缺血再灌注组(CI/R+ML-7组)；⑤NOX抑制剂DPI+脑缺血再灌注组(DPI+CI/R组)；⑥NOX抑制剂apocynin+脑缺血再灌注组(apocynin+CI/R组)；⑦溶媒+脑缺血再灌注组(CI/R+溶媒组)。采用Bederson评分法对大鼠神经学功能进行评分,HE染色观察病理组织形态学特点,TTC染色观察并计算梗死灶体积,DNA缺口末端原位标记(TUNEL染色观察细胞凋亡。收集各组动物脑组织,比色法测定脑中H2O2的含量、NOX、caspase-3活性,ELISA法测脑组织中MLCK的活性。收集脑组织并提取RNA和蛋白,测定NOX1-4的mRNA表达,NOX1、2、4及p-MLC20的蛋白表达。3、结果：(1)与对照组相比,脑缺血／再灌注组大鼠死亡率显著升高,并伴随明显的神经学功能缺陷和脑梗死灶,这些现象均可被ML-7、DPI或apocynin显著减轻；(2)与对照组相比,脑缺血／再灌注组大鼠脑组织水肿,有空泡形成,核固缩溶解,核仁消失,神经元间隙扩大,排列失去正常规则。给予ML-7、DPI或apocynin处理后,神经元损伤明显减轻,损伤神经元数量减少,缺血区域存活神经元增多,边界及核仁清楚,只有部分细胞出现胞核萎缩,胞浆消失。(3)对比正常对照组,TUNEL阳性细胞数和caspase-3活性在缺血/再灌注组大鼠脑组织中显著增加,ML-7、DPI或apocynin干预组,凋亡细胞数和caspase-3活性显著下降。(4)与正常组相比,脑缺血/再灌注组大鼠脑组织中NOX2, NOX4的mRNA及蛋白表达水平明显上调,H2O2含量和NOX活性显著增加,这些变化均可被ML-7、DPI或apocynin减弱；(5)与正常组相比,缺血／再灌注组大鼠脑组织MLCK活性显著升高,伴随总蛋白和核蛋白中MLC20蛋白磷酸化水平显著上调,这些现象可被MLCK抑制剂ML-7减弱,但不受NOX抑制剂的影响。4、结论：脑缺血／再灌注时,NOX2和NOX4基因表达上调和NADPH氧化酶活性升高是导致缺血／再灌注氧化应激损伤的重要原因。脑缺血／再灌注时MLC20通过蛋白磷酸化水平变化参与了NOX2和NOX4基因的表达调节。