原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界范围内常见的恶性肿瘤,发病率居所有恶性肿瘤第6位。随着近年肿瘤预防策略的施行及精准医疗的不断进步,肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多个癌种的死亡率均有所下降。与之相反的是,肝癌患者的死亡率尤其在女性患者却呈现出轻微增长的趋势,寻找新的有效的治疗靶标是提高肝癌治疗疗效亟待解决的问题。乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）是诱发HCC发生的主要危险因素,由于HBV缺乏DNA校正酶及病毒在体内的高丰度存在,HBV基因极易出现变异。我们的前期研究鉴定出12个位于HBV X基因区（HBx）和HBV相关性肝癌预后有关的突变位点,本研究进一步探讨可增加肝癌恶性度的敏感突变点,并阐明可能的相关机制及探索针对HBx突变点的靶向药物,以期降低肝癌患者的病死率。目前针对肝癌靶向药物的研发逐渐成为热点,而其精确的分子机制尚未完全阐明,导致一些靶向制剂对肝癌患者个体的治疗效果差异大,药物靶向性较低。目前免疫治疗在恶性肿瘤中显示出惊人的疗效,但仅有少部分肝癌患者从免疫治疗中获益,其客观缓解率为20%甚至更低。靶向药物联合免疫治疗是否会起到协同效应需要更多的临床数据支持。本研究分为以下三部分:第一部分乙肝病毒X基因突变型对肝癌细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡生物学行为的影响目的:构建稳定表达HBx及突变型（HBx C1653T、HBx T1753C）的Hep G2、Huh7细胞株,并探讨突变型对肝癌细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡生物学行为的影响。方法:以NCBI数据库中ayr型HBV基因组（X04615.1）HBx片段为模板,通过PCR点突变合成p LVX-HBx C1653T-IRES-td Tomato、p LVX-HBx T1753C-IRES-td Tomato慢病毒质粒,双酶切及Sanger测序鉴定质粒的正确性。包装慢病毒感染Hep G2、Huh7细胞,嘌呤霉素筛选阳性克隆。未做任何处理的Hep G2、Huh7细胞为对照组,转染HBx、HBx C1653T、HBx T1753C的细胞为实验组。免疫染色和Western blot法检测乙肝病毒X蛋白（HBX）的表达鉴定稳转株的构建;CCK-8法测定细胞的增殖能力;Transwell测定细胞侵袭、迁移能力;流式细胞术测定细胞凋亡;裸鼠皮下成瘤模型测定HBx突变型在体内环境中对肝癌细胞的影响。两组间进行独立样本t检验。结果:1.成功构建HBx及突变型慢病毒质粒构建的p LVX-HBx-IRES-td Tomato、p LVX-HBx C1653T-IRES-td Tomat o、p LVX-HBx T1753C-IRES-td Tomato慢病毒质粒经Eco RⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后均得到两个大小约9300bp和465bp的片段,Sanger测序结果显示点突变位置及碱基替换正确,表明成功构建HBx及突变型慢病毒质粒,符合下一步实验要求。2.慢病毒包装采用慢病毒包装体系将重组质粒p LVX-HBx-IRES-td Tomato、p LVX-HBx C1653T-IRES-td Tomat、p LVX-HBx T1753C-IRES-td Tomato转染293T细胞,48h后荧光显微镜下观察几乎所有293T细胞均携带红色荧光,说明慢病毒包装成功。3.稳转株的构建包装的慢病毒液直接感染Hep G2、Huh7细胞,48h后加入0.6μg/ml嘌呤霉素筛选阳性克隆。免疫染色及Western Blot检测均显示对照组细胞无HBX表达,实验组细胞均有HBX表达,表明成功构建稳定表达HBx及突变型HBx C1653T和HBx T1753C的Hep G2、Huh7稳转株,为下步功能实验研究提供了基础。4.HBx C1653T突变促进肝癌细胞的增殖CCK-8增殖实验表明,和对照组相比,从24h开始,HBx及突变型均明显促进肝癌细胞的增殖（P＜0.01）。在HBx促进肝癌细胞增殖的基础上,HBx C1653T突变进一步促进了肝癌细胞的增殖（P＜0.05）。HBx T1753C突变促进肝癌增殖趋势和HBx无明显统计学差异。5.HBx C1653T突变促进肝癌细胞的侵袭和迁移Transwell实验表明,和对照组相比,HBx及HBx C1653T突变可促进肝癌细胞的侵袭（P＜0.01）和迁移（P＜0.01）。和HBx比较,HBx C1653T突变进一步增强了肝癌细胞的侵袭（P＜0.01）和迁移（P＜0.01）能力。HBx T1753C突变对肝癌细胞侵袭迁移的影响和对照组无明显统计学差异。6.HBx C1653T突变抑制肝癌细胞的凋亡流式细胞术表明,和对照组相比,HBx和HBx C1653T突变抑制了肝癌细胞的凋亡（P＜0.01）。和HBx比较,HBx C1653T突变进一步抑制了肝癌细胞的凋亡（P＜0.01）。HBx T1753C突变对肝癌细胞凋亡的影响和对照组无明显统计学差异。7.HBx C1653T突变在体内环境中明显促进瘤体生长并具有更强的侵袭性因HBx C1653T突变可明显增加肝癌的恶性度,进一步探讨该突变在体内环境中对肝癌的影响。裸鼠皮下成瘤实验表明,和对照组相比,接种HBx、1653组细胞悬液的裸鼠瘤体增长速度快（P＜0.05）。在HBx促进裸鼠瘤体增长基础上,HBx C1653T突变进一步促进了裸鼠瘤体的增长（P＜0.05）。HE染色结果表明,三组裸鼠皮下移植瘤体均为低分化恶性肿瘤,且1653组存在横纹肌成分,表明1653组瘤体浸润肌层组织,具有更强的侵袭性。小结:1.稳定表达HBx及突变型C1653T和T1753C的Hep G2、Huh7稳转株的构建为后续实验研究提供了基础。2.HBx C1653T突变增加了肝癌细胞的恶性度,而HBx T1753C突变对肝癌细胞的恶性度未产生明显影响。3.进一步于体内实验证明HBx C1653T突变明显促进瘤体增殖且具有更强的侵袭性。第二部分乙肝病毒X基因突变型影响肝癌生物学行为的机制目的:探讨HBx突变型影响肝癌细胞生物学行为的作用机制,并观察其对阿帕替尼的敏感性,以期为肝癌治疗寻求新的靶点。方法:选取稳定表达HBx及突变型的Hep G2细胞（HBX组、1653组、1753组）进行相关的机制研究。化学发光免疫分析法测定纤维化程度;高灵敏度活性氧检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平;流式免疫荧光微球技术检测细胞因子水平。阿帕替尼干预后CCK-8法测定细胞的增殖能力;Western blot检测突变型对阿帕替尼靶作用点血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响。两组间进行独立样本t检验。结果:1.HBx C1653T突变加重肝脏纤维化程度为了评估HBx及突变型对肝脏纤维化的影响,我们测定了各组细胞培养液上清中透明质酸（Hyaluronan,HA）、Ⅲ型胶原N端肽（TypeⅢprocollagen,PⅢNP）和Ⅳ型胶原（TypeⅣcollagen,ColⅣ）的水平。和对照组相比,HBX组和1653组的HA和ColⅣ水平均明显升高（P＜0.01）,1653组的HA和ColⅣ水平较HBx组进一步升高（P＜0.01）。HBx T1753C突变仅升高了HA水平（P＜0.01）。PⅢNP水平在各组之间无明显统计学差异。2.HBx C1653T突变加重细胞内ROS高灵敏度活性氧检测表明,和对照组相比,HBX组和1653组的ROS水平均明显升高（P＜0.01）,而1653组的ROS水平较HBX组进一步升高（P＜0.01）。HBx T1753C突变并未明显增加ROS的产生。以上结果表明,HBx C1653T突变可能通过加重纤维化及ROS增加肝癌的恶性度。3.HBx C1653T突变引起细胞因子的变化我们检测了各组细胞培养上清中12种细胞因子的变化,其中人单核细胞趋化蛋白（Monocyte Chemotactic protein-1,MCP-1）和白细胞介素18（Interleukin18,IL18）的差异在各组之间比较明显。和对照组相比,HBX和1653组的MCP-1水平明显升高、IL-18水平明显下降（P＜0.01）,而HBx T1753C突变仅降低了IL18水平（P＜0.05）,且下降程度低于HBX和1653组。和HBX组比较,HBx C1653T突变进一步提高了MCP-1水平及降低IL18水平（P＜0.05）。4.HBx C1653T突变对阿帕替尼敏感阿帕替尼在中国被用作HCC的二线治疗,尚无HBx突变型对阿帕替尼敏感性的研究。我们检测了阿帕替尼对HBx突变型的Hep G2细胞增殖的抑制率。经过阿帕替尼的浓度筛选,采用2.5μmol/L和5μmol/L的浓度进行药敏试验。增殖试验表明,HBX组和1653组的增殖能力在阿帕替尼干预后48-72h的时间点上都受到了抑制,但1753组对阿帕替尼治疗有抵抗性。阿帕替尼引起的抑制作用与时间和浓度呈相关性。在72h的时间点上,对照组、HBX组和1653组在2.5μmol/L浓度下对Hep G2细胞生长的抑制率分别为19.2%、20%和23.7%,而在5μmol/L浓度下对Hep G2细胞的抑制率分别为26.3%、23.8%和69.7%。以上结果表明HBx C1653T突变虽然增加了肝癌细胞的恶性度,但对阿帕替尼治疗相对敏感。5.HBx C1653T突变可能通过诱导VEGF高表达增加对阿帕替尼的敏感性阿帕替尼为高度选择性VEGFR-2受体拮抗剂,Western blot检测结果显示,VEGF的表达量在对照组、HBX组、1653组依次升高,而1753组VEGF表达量稍低于对照组。以上数据表明HBx C1653T突变对阿帕替尼治疗敏感,过度表达的VEGF可能参与了这一过程。小结:1.HBx C1653T突变可能通过促进肝纤维化及加重ROS、升高MCP-1并降低IL18水平来增加肝癌的恶性度。2.HBx C1653T突变型虽然增加了肝癌细胞的恶性,体外实验表明对阿帕替尼敏感,过度表达的VEGF可能参与了这一过程。第三部分靶向药物联合免疫治疗中晚期肝癌的有效性和安全性分析:一项单中心、回顾性分析目的:本研究旨在观察靶向药物联合免疫治疗中晚期肝癌患者的有效性和安全性,初步探讨可预测联合治疗疗效的相关标志物。方法:回顾性的分析2019年5月至2021年8月于河北医科大学第四医院接受靶向药物联合免疫治疗的中晚期肝癌患者。主要研究终点为无进展生存期（Progression Free Survival,PFS）,次要研究终点是疾病控制率（Disease Control Rate,DCR）、客观有效率（Overall Response Rate,ORR）、总生存期（Overall Survival,OS）,并分析联合治疗的安全性。结果:1.靶向药物联合免疫治疗的有效性共53例患者纳入本研究,总体ORR为18.9%,DCR为52.8%。Ⅱ、Ⅲ期患者接受联合治疗后的DCR明显优于Ⅳ期患者（P=0.003）,而联合治疗后的ORR或DCR与患者年龄、性别、体力活动状态（Performance Status,PS）评分、门脉瘤栓、治疗线数、有无乙肝、Child分级、AFP及有无免疫相关不良反应（Immune-Related Adverse Events,ir AEs）发生无明显相关性。2.Ⅱ、Ⅲ期患者接受联合治疗具有更优的PFS单因素生存分析显示Ⅱ、Ⅲ期患者接受联合治疗后PFS明显优于Ⅳ期患者（P=0.000）,而患者年龄、性别、PS评分、门脉瘤栓、治疗线数、有无乙肝、Child分级、AFP及有无ir AEs与患者PFS无明显相关性。3.无门脉瘤栓患者接受联合治疗具有更优的OS单因素生存分析显示无门脉瘤栓的患者接受联合治疗后OS优于有门脉瘤栓患者（P=0.048）,而患者年龄、性别、PS评分、治疗线数、分期、有无乙肝、Child分级、AFP及有无ir AEs与患者OS无明显相关性。4.治疗线数、分期、门脉瘤栓为影响联合治疗预后的相关因素将可能影响预后的因素纳入多因素Cox回归分析以确定影响联合治疗的独立预后因素。治疗线数（P=0.044）和分期（P=0.001）是影响患者PFS的独立危险因素;有无门脉瘤栓（P=0.021）及分期（P=0.038）是影响患者OS的独立危险因素。5.靶向药物联合免疫治疗的安全性总体的ir AEs发生率为54.7%,最常见的ir AEs是甲状腺功能减退症。患者年龄、性别、PS评分、有无门脉瘤栓、治疗线数、有无乙肝、Child分级、分期、AFP与ir AEs发生没有明显相关性。小结:1.靶向药物联合免疫治疗中晚期肝癌的DCR达52.8%,Ⅱ、Ⅲ期且无门脉瘤栓患者更适宜接受联合治疗。2.治疗线数、分期、有无门脉瘤栓为影响联合治疗预后的独立危险因素。3.靶向联合免疫治疗中晚期肝癌患者的安全性可控,年龄、性别、PS评分、Child分级、治疗线数、有无门脉瘤栓、有无乙肝、AFP水平与ir AEs的发生无明显相关性。结论:1.HBx C1653T突变可通过加重纤维化程度及细胞内ROS、升高MCP-1并降低IL18的水平促进肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移并抑制肝癌细胞的凋亡。2.HBx C1653T突变可能通过诱导VEGF高表达增加对阿帕替尼的敏感性,该突变可作为筛选阿帕替尼治疗肝癌疗效的潜在分子分型。3.靶向药物联合免疫治疗中晚期肝癌是一个有效安全的方案,尤其对于Ⅱ、Ⅲ期且无门脉瘤栓患者。4.治疗线数、分期、有无门脉瘤栓为影响靶向药物联合免疫治疗预后的独立危险因素。