据2020年全球癌症报告统计,肺癌全球新发病例高达220万,死亡病例高达180万,发病率及死亡率均居全球前列。其中,肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）约占肺癌全部病例的40%,是一种高度恶性和异质性的疾病。LUAD起病隐匿,患者在确诊时已处于病程晚期,此时,以铂类药物为主的联合化疗成为临床首选治疗方案。然而,化疗易导致耐药发生,患者预后差,死亡率高。微小RNA（micro RNA,miRNA）在肿瘤发生发展过程中扮演着重要的角色,参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、血管生成及化疗耐药等多个生物学过程。研究发现,miRNA调控化疗耐药是多分子、多因素的复杂过程,主要机制包括:DNA损伤修复、上皮间充质转化、药物转运、氧化还原稳态和自噬等,但其中任何一种机制都不可能完全清楚阐述化疗耐药的发生。目前对具体miRNA调控化疗耐药的研究还较少,因此,迫切需要寻找新的miRNA分子并深入研究其耐药机制,降低LUAD化疗耐药的发生。本研究旨在利用生物信息学分析LUAD顺铂耐药与敏感相关miRNA微阵列,筛选并鉴定出差异表达的特定miRNA,通过实验验证其在顺铂耐药LUAD细胞中的异常表达情况;并深入探讨该分子参与LUAD顺铂耐药的分子机制。本研究可能对攻克LUAD顺铂化疗耐药,增强化疗疗效,改善患者预后都具有一定的意义。第一部分基于生物信息学分析肺腺癌顺铂耐药相关基因miR-125b-5p目的:应用生物信息学方法分析miR-125b-5p在LUAD中的表达,预测其靶基因及预后价值。方法:1.选取GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中LUAD顺铂耐药相关组织芯片数据集GSE56036、GSE168707及顺铂耐药相关细胞芯片数据集GSE43249、GSE157692,应用R软件筛选差异表达miRNA,运用venny在线工具取交集,获得与耐药密切相关的差异表达miRNA。2.应用miRBase数据库分析miR-125b-5p保守性。3.采用db DEMC3.0数据库分析miR-125b-5p在泛癌中表达情况,同时,下载TCGA（the Cancer Genome Atlas）数据库中LUAD信息,进一步验证miR-125b-5p表达水平。4.利用Target Scan、miRDB、miRTar Base数据库预测miR-125b-5p靶基因,并将3个数据库的靶基因取交集。5.利用DAVID在线网站对上述交集靶基因进行基因本体（Gene Ontology,GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG）生物通路富集分析。6.下载TCGA数据库LUAD患者生存信息,分析miR-125b-5p与LUAD预后的关系。7.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）技术检测miR-125b-5p在人正常支气管上皮细胞系16HBE,LUAD细胞系A549,以及顺铂耐药细胞系A549/DDP中的表达水平。结果:1.4个LUAD顺铂耐药相关芯片差异表达分析结果显示,GSE56036中41个,GSE168707中20个,GSE43249中145个以及GSE157692中301个差异表达的miRNA,venny图取交集后获得与耐药密切相关的差异表达基因miR-125b-5p。2.miR-125b-5p序列在人、小家鼠、大鼠、家兔、猪、猕猴、马、蟾蜍等49个物种中完全一致,在物种间具有高度保守性。3.db DEMC3.0及TCGA数据库分析结果显示,miR-125b-5p在包含LUAD的21种肿瘤中表达水平下调。4.Target Scan、miRDB、miRTar Base数据库预测miR-125b-5p靶基因,取交集后获得54个基因。5.GO和KEGG结果显示,54个靶基因主要富集在调节基因表达、细胞大分子生物合成等过程;并显著富集于Micro RNAs in cancer、Protein processing in endoplasmic reticulum以及HIF-1 signaling pathway等通路。6.Kaplan-Meier生存分析结果提示,miR-125b-5p低表达与LUAD患者预后不良相关（P=0.010）。7.q RT-PCR结果显示,miR-125b-5p在A549细胞中表达水平显著低于16HBE（P=0.008）;与亲本细胞相比,在耐药细胞A549/DDP中表达水平明显下降（P=0.023）。结论:基于生物信息学预测miR-125b-5p在LUAD中表达异常,其靶基因参与调控多个生物学过程及信号通路,miR-125b-5p可能是LUAD预后的生物标志物。第二部分miR-125b-5p通过RORA/BNIP3L调控自噬逆转A549/DDP细胞顺铂耐药性目的:研究miR-125b-5p对A549/DDP细胞顺铂耐药性及自噬的影响,并探讨其潜在机制。方法:1.A549/DDP细胞转染5-羧基荧光素（FAM）标记的无关序列（Negative Control,NC）即NC-FAM 24h,荧光显微镜下观察转染效果。2.A549/DDP细胞转染NC/miR-125b-5p mimics（以下简称mimics）和NC-inhibitor/miR-125b-5p inhibitor（以下简称inhibitor）24h,q RT-PCR技术检测miR-125b-5p的过表达或干扰效果。3.A549/DDP细胞转染NC/mimics、NC-inhibitor/inhibitor 24h,梯度浓度顺铂（0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml）作用24h,MTT法检测增殖活力。4.A549/DDP细胞转染NC/mimics、NC-inhibitor/inhibitor 48h,蛋白印迹技术检测耐药相关基因P-gp、MVP的蛋白表达水平。5.A549/DDP细胞转染NC/mimics、NC-inhibitor/inhibitor 48h,蛋白印迹技术检测自噬相关基因LC3B-Ⅱ、P62、beclin1、BNIP3L的蛋白表达水平。6.A549/DDP细胞转染NC/mimics、NC-inhibitor/inhibitor 24h,q RT-PCR技术检测自噬相关基因LC3B、P62、beclin1、BNIP3L的m RNA表达水平。7.A549/DDP细胞转染NC/mimics、NC-inhibitor/inhibitor 24h,Ad-GFP-m Cherry-LC3B腺病毒感染24h,激光共聚焦显微镜观察各组细胞黄色斑点（GFP+/m Cherry+）和红色斑点（GFP-/m Cherry+）个数。8.A549/DDP细胞转染NC/mimics、NC-inhibitor/inhibitor 24h,自噬抑制剂3-MA（5m M）预处理1h,继续与顺铂（1/10IC50）联合作用24h。设置如下分组:NC/mimics组、NC/mimics+3-MA组;NC-inhibitor/inhibitor组、NC-inhibitor/inhibitor+3-MA组,MTT法检测细胞抑制率,蛋白印迹技术检测耐药相关基因P-gp、MVP的蛋白表达水平。9.A549/DDP细胞共转染inhibitor和BNIP3L干扰质粒24h,顺铂（1/10IC50）作用24h,设置如下分组:NC-inhibitor组、inhibitor组、si-BNIP3L组、inhibitor+si-BNIP3L组,MTT法检测细胞抑制率,蛋白印迹技术检测耐药相关基因P-gp、MVP的蛋白表达水平。10.miRDB在线数据库预测miR-125b-5p靶基因,JASPAR及UCSC数据库预测与BNIP3L启动子区域结合的转录因子,两者取交集,获得miR-125b-5p影响自噬基因BNIP3L的可能通路。GEO芯片及TCGA数据库分析miR-125b-5p、RORA和BNIP3L的表达水平。蛋白印迹技术和q RT-PCR技术分别检测16HBE、A549、A549/DDP细胞中miR-125b-5p、RORA和BNIP3L的蛋白和m RNA表达水平。11.A549/DDP细胞转染NC/mimics、NC-inhibitor/inhibitor 48h,蛋白印迹技术检测RORA蛋白表达水平。12.A549/DDP细胞转染NC/mimics、NC-inhibitor/inhibitor 24h,q RT-PCR技术检测RORA m RNA表达水平。13.双荧光素酶报告基因实验检测miR-125b-5p与RORA直接结合,实验分组如下:RORA 3’-UTR WT+NC组、RORA 3’-UTR WT+mimics组、RORA 3’-UTR MUT+NC组、RORA 3’-UTR MUT+mimics组。14.双荧光素酶报告基因实验检测RORA与BNIP3L启动子区域直接结合,实验分组如下:pc DNA3.1（+）+GPL4空载体+海肾组、RORA+GPL4空载体+海肾组、pc DNA3.1（+）+BNIP3L-promo+海肾组、RORA+BNIP3L-promo+海肾组。15.A549/DDP细胞转染NC、mimics、RORA、mimics+RORA,48h后,蛋白印迹技术检测RORA及BNIP3L的表达水平。16.A549/DDP细胞转染NC、mimics、mimics+RORA、mimics+RORA+si-BNIP3L,48h后,蛋白印迹技术检测LC3B-Ⅱ、P62、beclin1的蛋白表达水平。17.A549/DDP细胞转染NC、mimics、mimics+RORA、mimics+RORA+si-BNIP3L,24h后,顺铂（1/10IC50）作用24h,MTT法检测细胞抑制率,蛋白印迹技术检测P-gp、MVP的蛋白表达水平。结果:1.荧光显微镜观察NC-FAM瞬时转染效率约为83.12±8.41%。2.mimics可以显著升高A549/DDP细胞中miR-125b-5p水平,inhibitor可以显著降低A549/DDP细胞中miR-125b-5p水平。q RT-PCR结果显示,在A549/DDP细胞中转染mimics后,miR-125b-5p表达水平较空白对照组及NC组,均明显升高（F=279.009,P＜0.001）;在A549/DDP细胞中转染inhibitor后,miR-125b-5p表达水平较空白对照组及NC-inhibitor组,均明显降低（F=17.307,P=0.003）。3.miR-125b-5p降低顺铂作用下A549/DDP细胞的增殖活力。MTT结果显示,在A549/DDP细胞中转染mimics后,与空白对照组及NC组相比,mimics降低了顺铂处理的A549/DDP细胞增殖活力,且显著降低了IC50值（F=29.993,P=0.001）;在A549/DDP细胞中转染inhibitor后,与空白对照组及NC-inhibitor组相比,inhibitor提高了顺铂处理的A549/DDP细胞增殖活力,且显著升高了IC50值（F=11.236,P=0.009）。4.miR-125b-5p下调A549/DDP细胞中耐药相关基因P-gp、MVP的蛋白表达水平。蛋白印迹结果显示,在A549/DDP细胞中转染mimics后,与空白对照组及NC组相比,P-gp（F=68.491,P＜0.001）、MVP（F=58.599,P＜0.001）蛋白表达水平显著下调;而在A549/DDP细胞中转染inhibitor后,与空白对照组及NC-inhibitor组相比,P-gp（F=72.006,P＜0.001）、MVP（F=30.013,P=0.001）表达水平显著上调。5.miR-125b-5p下调A549/DDP细胞中LC3B-Ⅱ、beclin1、BNIP3L以及上调P62的蛋白表达水平。蛋白印迹结果显示,在A549/DDP细胞中转染mimics后,与空白对照组及NC组相比,LC3B-Ⅱ（F=8.943,P=0.016）、beclin1（F=358.328,P＜0.001）、BNIP3L（F=44.405,P＜0.001）表达水平显著下调,P62表达水平显著上调（F=113.497,P＜0.001）;而在A549/DDP细胞中转染inhibitor后,与空白对照组及NC-inhibitor组相比,LC3B-Ⅱ（F=67.658,P＜0.001）、beclin1（F=73.972,P＜0.001）、BNIP3L（F=47.379,P＜0.001）表达水平显著上调,P62表达水平显著下调（F=34.716,P=0.001）。6.miR-125b-5p下调A549/DDP细胞中LC3B、beclin1、BNIP3L以及上调P62 m RNA的表达。q RT-PCR结果显示,在A549/DDP细胞中转染mimics后,与空白对照组及NC组相比,LC3B（F=22.843,P=0.002）、beclin1（F=23.991,P＜0.001）、BNIP3L（F=11.707,P=0.008）m RNA表达水平显著下调,P62 m RNA表达水平显著上调（F=7.599,P=0.023）;而在A549/DDP细胞中转染inhibitor后,与空白对照组及NC-inhibitor组相比,LC3B（F=31.478,P=0.001）、beclin1（F=6.792,P=0.029）、BNIP3L（F=24.877,P=0.001）m RNA表达水平显著上调,P62 m RNA表达水平显著下调（F=14.517,P=0.005）。7.miR-125b-5p抑制自噬小体的形成。Ad-GFP-m Cherry-LC3B腺病毒感染实验结果显示,转染mimics后,与空白对照组及NC组相比,黄色斑点m Cherry+/GFP+（F=21.866,P＜0.001）及红色斑点m Cherry+/GFP-（F=27.469,P＜0.001）数目显著减少;而转染inhibitor后,与空白对照组及NC-inhibitor组相比,黄色斑点m Cherry+/GFP+（F=4.655,P=0.013）及红色斑点m Cherry+/GFP-（F=36.423,P＜0.001）数目显著增加。8.miR-125b-5p增强了自噬抑制剂3-MA对A549/DDP顺铂耐药的逆转作用。MTT结果显示,mimics显著增加顺铂对A549/DDP细胞的抑制作用（P＜0.001）;联合3-MA之后,相较于NC+3-MA组,mimics（P=0.025）增强了顺铂对细胞的抑制作用。同时,inhibitor显著降低了顺铂对A549/DDP细胞的抑制作用（P=0.001）;联合3-MA之后,相较于NC-inhibitor+3-MA组,inhibitor部分恢复了顺铂对A549/DDP细胞的抑制作用（P=0.023）。9.miR-125b-5p与自噬抑制剂3-MA协同促进P-gp和MVP的表达下调。蛋白印迹结果显示,mimics显著下调P-gp（P＜0.001）、MVP（P=0.002）的蛋白表达水平;联合3-MA之后,mimics增强了对P-gp（P=0.001）、MVP（P=0.013）蛋白水平的下调作用。同时,inhibitor显著上调P-gp（P=0.004）、MVP（P＜0.001）的蛋白表达水平;联合3-MA之后,inhibitor部分恢复了P-gp（P=0.038）、MVP（P=0.013）的蛋白表达水平。10.BNIP3L敲除降低了A549/DDP细胞顺铂耐药性,抑制miR-125b-5p可部分挽救。MTT结果显示,inhibitor显著降低了顺铂对A549/DDP细胞的抑制作用（P=0.009）;联合si-BNIP3L后,inhibitor部分挽救了si-BNIP3L导致的顺铂对A549/DDP细胞的抑制作用（P＜0.001）。11.BNIP3L敲除导致A549/DDP细胞中P-gp、MVP蛋白表达减少,抑制miR-125b-5p可部分挽救。蛋白印迹结果显示,inhibitor显著上调了P-gp（P＜0.001）、MVP（P＜0.001）的蛋白表达水平;联合si-BNIP3L后,inhibitor部分恢复了si-BNIP3L导致的A549/DDP细胞P-gp（P＜0.001）、MVP（P＜0.001）蛋白表达下调作用。12.通过生物信息学预测了miR-125b-5p/RORA/BNIP3L轴。芯片GSE157692数据显示,与A549细胞相比,A549/DDP细胞中miR-125b-5p表达水平显著降低（t=6.109,P=0.026）;RORA（t=-2.861,P=0.046）和BNIP3L（t=-7.250,P=0.019）m RNA表达水平均显著升高。TCGA数据库517例LUAD患者中RORA与BNIP3L的表达水平成正相关（r=0.125,P=0.004）。蛋白印迹结果显示,RORA（F=238.759,P＜0.001）、BNIP3L（F=482.701,P＜0.001）在16HBE细胞、A549细胞和A549/DDP细胞中的蛋白表达水平依次升高,差异具有统计学意义。q RT-PCR结果显示,与16HBE细胞相比,A549细胞中RORA m RNA表达水平无差异（P=0.720）;与A549细胞相比,A549/DDP细胞中RORA m RNA表达水平显著升高（P＜0.001）。而BNIP3L在16HBE细胞、A549细胞和A549/DDP细胞中的m RNA表达水平依次升高,差异具有统计学意义（F=41.856,P＜0.001）。13.miR-125b-5p能够调控RORA蛋白表达水平。蛋白印迹结果显示,转染mimics后,与空白对照组及NC组相比,RORA表达水平显著降低（F=37.038,P＜0.001）;而转染inhibitor后,与空白对照组及NC-inhibitor组相比,RORA表达水平显著增加（F=23.471,P=0.001）。14.miR-125b-5p能够调控RORA m RNA水平。q RT-PCR结果显示,转染mimics后,与空白对照组及NC组相比,RORA m RNA表达水平显著降低（F=41.407,P＜0.001）;而转染inhibitor后,与空白对照组及NC-inhibitor组相比,RORA m RNA表达水平显著增加（F=16.942,P=0.003）。15.miR-125b-5p直接结合RORA并抑制其表达。双荧光素酶报告基因实验结果显示,与对照组相比,RORA 3’-UTR WT+mimics组相对荧光素酶活性显著降低（F=21.837,P＜0.001）。16.RORA能与BNIP3L启动子区域直接结合,促进其表达。双荧光素酶报告基因实验结果显示,RORA+BNIP3L-promo+海肾组的相对荧光素酶活性显著高于pc DNA3.1（+）+BNIP3L-promo+海肾组,差异具有统计学意义（t=-7.596,P=0.017）。17.miR-125b-5p通过RORA调控BNIP3L的表达。蛋白印迹结果显示,与NC组相比,mimics组中的RORA（P=0.047）、BNIP3L（P＜0.001）的蛋白表达水平显著降低,而RORA组中的RORA（P＜0.001）、BNIP3L（P＜0.001）的蛋白表达水平显著升高且与RORA组相比,mimics+RORA组中RORA（P＜0.001）、BNIP3L（P=0.001）的蛋白表达水平显著降低。18.miR-125b-5p通过RORA/BNIP3L调控自噬。蛋白印迹结果显示,与NC组相比,mimics组中LC3B-Ⅱ（P＜0.001）、beclin1（P=0.033）蛋白表达水平均显著降低;与mimics组相比,mimics+RORA组中LC3B-Ⅱ（P＜0.001）、beclin1（P=0.001）蛋白表达水平显著升高;与mimics+RORA组相比,mimics+RORA+si-BNIP3L组中LC3B-Ⅱ（P＜0.001）、beclin1（P＜0.001）蛋白表达水平显著降低。而与NC组相比,mimics组中P62蛋白表达水平显著升高（P＜0.001）;与mimics组相比,mimics+RORA组中P62蛋白表达水平显著降低（P＜0.001）;与mimics+RORA组相比,mimics+RORA+si-BNIP3L组中P62蛋白表达水平显著升高（P=0.042）。19.miR-125b-5p通过RORA/BNIP3L调控A549/DDP细胞顺铂耐药性。MTT结果显示,与NC组相比,mimics组的细胞抑制率显著增加（P＜0.001）;与mimics组相比,mimics+RORA组的细胞抑制率显著降低（P=0.006）;与mimics+RORA组相比,mimics+RORA+si-BNIP3L组的细胞抑制率显著升高（P＜0.001）。20.miR-125b-5p通过RORA/BNIP3L降低A549/DDP细胞中耐药相关基因P-gp、MVP的蛋白表达。蛋白印迹结果显示,与NC组相比,mimics组中BNIP3L（P=0.001）、P-gp（P=0.001）、MVP（P=0.002）蛋白表达水平均显著降低;与mimics组相比,mimics+RORA组中BNIP3L（P＜0.001）、P-gp（P＜0.001）、MVP（P=0.018）蛋白表达水平显著升高;与mimics+RORA组相比,mimics+RORA+si-BNIP3L组中BNIP3L（P＜0.001）、P-gp（P＜0.001）、MVP（P＜0.001）蛋白表达水平显著降低。结论:1.miR-125b-5p逆转A549/DDP细胞顺铂耐药性,抑制A549/DDP细胞自噬,且miR-125b-5p通过抑制自噬逆转A549/DDP细胞顺铂耐药性。2.miR-125b-5p可能通过RORA/BNIP3L途径调控自噬逆转A549/DDP细胞顺铂耐药性。