[研究背景与目的]乳腺癌是目前全球女性癌症中发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,远端转移是其致患者死亡的重要原因。中医学认为,乳腺癌属七情异常所致之病,情志失调、肝气郁结乃至肝郁化火是其主要病因病机,这与现代医学认为的慢性压力应激参与乳腺癌发生发展的观点不谋而合。因此,针对长期情志异常或处于应激状态的乳腺癌患者,中医通常使用疏肝理气药配伍清热药治疗,其中中药黄芩是使用频次较高的一味清热药。黄芩苷（Baicalin,BA）作为黄芩的主要活性成分,被证实在肺癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤上具有显著抗癌疗效,但目前关于其在情志异常或慢性应激所致乳腺癌转移上的研究颇少。课题组前期探索发现,在MDA-MB-231细胞构建的乳腺癌原位瘤模型中,黄芩苷可抑制慢性束缚应激诱导的乳腺癌肝、肺转移。因此,本课题将在MDA-MB-231尾静脉转移模型上探讨黄芩苷是否具有同样的效应,并挖掘其潜在作用靶标,以期为临床上应用疏肝解郁药配伍黄芩治疗乳腺癌提供依据。[研究内容与结果]本课题首先在MDA-MB-231细胞构建的尾静脉转移模型上,证实黄芩苷可抑制慢性束缚应激诱导的乳腺癌转移,同时体外划痕愈伤、Transwell迁移、3D肿瘤球侵袭实验表明,肾上腺素（Epinephrine,Epi）、去甲肾上腺素（Norepinephrine,NE）、糖皮质激素（Corticosteroid,Cort）中Epi促进MDA-MB-231细胞迁移、侵袭的作用更为显著,且黄芩苷可抑制其作用,因此将Epi作为体外模拟慢性应激的刺激因子,挖掘黄芩苷的作用靶标。通过生物大数据分析、基于靶点稳定性的药物亲和反应（Drug Affinity Responsive Target Stability,DARTS）技术联合分子对接,筛选到黄芩苷抑制慢性应激下Epi诱导的乳腺癌转移的潜在靶标β2-肾上腺素能受体（β2-Adrenergic Receptor,β2-AR）。另外,借助黄芩苷光亲和探针标记技术及微量热泳动（Micro-Scale Thermophoresis,MST）分子互作实验,证实黄芩苷与β2-AR直接结合。进一步通过Western Blot、细胞免疫荧光、细胞内cAMPELISA检测实验,发现黄芩苷可抑制Epi处理下MDA-MB-231细胞β2-AR的激活,但对其蛋白表达无影响,并采用β2-AR特异性拮抗剂ICI 118551、激动剂沙美特罗（Salmeterol,Sal）进行正反向的效应验证。另外,竞争性与非竞争性结合实验、计算机虚拟氨基酸突变、氨基酸定点突变技术构建的β2-ARF193A,F289A突变的MDA-MB-231细胞联合DARTS、细胞热转移分析（Cellular Thermal Shift Assay,CETSA）实验及体外研究表明,黄芩苷通过非竞争性抑制β2-AR激活,从而抑制Epi诱导的乳腺癌细胞迁移、侵袭,其中Phe193、Phe289是黄芩苷与β2-AR结合并发挥作用的重要氨基酸。最后,考虑到黄芩苷体内代谢物黄芩素（Baicalein,Bai）,与黄芩苷结构相似,可能存在相同效应及机制,因此通过分子对接、MST分子互作实验、结合体外迁移、侵袭实验及细胞免疫荧光、cAMPELISA检测等研究,发现黄芩素同样可与β2-AR结合并抑制其激活而非蛋白表达,从而抑制Epi诱导的乳腺癌细胞迁移、侵袭。[结论与意义]通过上述研究,得出结论:黄芩苷通过结合β2-AR,非竞争性抑制Epi诱导的β2-AR激活,从而改善慢性应激诱导的乳腺癌转移,其中Phe193、Phe289是黄芩苷与β2-AR结合的重要氨基酸;此外,黄芩苷体内代谢物黄芩素可同样与β2-AR结合并抑制Epi诱导的乳腺癌细胞迁移、侵袭。该课题阐明了中药黄芩主要活性成分黄芩苷对慢性应激诱导的乳腺癌转移的作用及靶点,揭示了疏肝理气药配伍清热药黄芩治疗乳腺癌的科学内涵,为黄芩苷缓解情志异常所致乳腺癌转移的临床应用提供理论依据;同时为中药活性成分的作用靶标识别与鉴定提供思路及方法参考。