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目的通过对CD4、CD40分子作为脊柱结核靶向治疗靶标分子的可行性及靶向性能进行实验研究,来探讨脊柱结核分子靶向治疗的可能性。方法(1)使用感染复数(Multiplicity of infection,MOI)为10:1的荧光结核分枝杆菌(H37Ra-GFP)感染T淋巴细胞(CD4分子)与成骨细胞(CD40分子),并测定二者感染细菌的能力及感染细菌后分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的量。(2)将传3代的人成骨细胞随机分为A、B、C、D四组,A组为对照组,是未被荧光结核分枝杆菌感染的成骨细胞组;B、C、D三组均为实验组,分别是被感染复数为10:1、100:1、1000:1的荧光结核分枝杆菌感染的成骨细胞组;采用实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)与蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)的方法,检测不同感染复数荧光结核分枝杆菌对成骨细胞表面CD40分子表达的影响,根据(1)、(2)结果筛选出脊柱结核靶向治疗合适的靶细胞(靶标分子)。(3)CD40分子所对应的核酸适配体aptamer的合成及与成骨细胞特异结合能力的测定。(4)嵌合有沉默结核分枝杆菌中Mce4a基因的杂合反义寡核苷酸siLNA序列(LNA-DNA-LNA Gapmer antisense)、CD40分子所对应的核酸适配体aptamer序列的pRNA-3WJ纳米微粒的合成及其热力学稳定性测定。(5)使用流式细胞仪及荧光显微镜测定pRNA 3WJ-siLNA(Mce4a)-aptamer(CD40)纳米微粒与成骨细胞的特异结合能力。结果(1)成骨细胞吞噬结核分枝杆菌的能力强于T淋巴细胞,成骨细胞中的TNF-α释放量明显多于T淋巴细胞的释放量。(2)成骨细胞感染荧光结核分枝杆菌的程度与感染复数成正相关;A组实时定量PCR结果为成骨细胞中已存在CD40 mRNA的表达;A、B、C、D四组之间的表达存在差异(F=74.005,P<0.05);B、C、D三组分别与A组相比时,均存在差异(P<0.05),表现为B、C、D三组成骨细胞中CD40 mRNA的表达均高于A组;B、C、D三组,两两比较时,均存在差异(P<0.05),表现为从B组到D组成骨细胞中CD40 mRNA的表达依次上调;而蛋白免疫印迹法分析CD40分子的表达变化时,与上述CD40 mRNA表达上调的结果一致。(3)在核酸适配体aptamer处理成骨细胞后,细胞内的荧光数值明显增加。(4)通过逐步合成反应,成功合成出pRNA3WJ-siLNA(Mce4a)-aptamer(CD40)纳米微粒;pRNA 3WJ-siLNA(Mce4a)-aptamer(CD40)纳米微粒的熔点温度(Tm)为59±3℃,而pRNA-3WJ纳米微粒在50%血清中的半衰期为21.9小时。(5)pRNA 3WJ-siLNA(Mce4a)-aptamer(CD40)纳米微粒组对成骨细胞的处理使得Alexa647-A的峰明显右移;而pRNA 3WJ-siLNA(Mce4a)纳米微粒组对成骨细胞的处理,并未使Alexa647-A的峰明显右移,其峰移动的结果与对照组峰移动的结果相同;荧光显微镜观察到实验组pRNA 3WJ-siLNA(Mce4a)-aptamer(CD40)纳米微粒与成骨细胞特异结合并进入到细胞中,而对照组pRNA 3WJ-siLNA(Mce4a)纳米微粒不能与成骨细胞特异结合并进入到细胞中。结论(1)研究表明成骨细胞及其表达的CD40分子为脊柱结核靶向治疗的合适靶细胞与靶标分子;(2)本研究成功合成出pRNA 3WJ-siLNA(Mce4a)-aptamer(CD40)纳米微粒,且其热力学性能稳定,可用于之后对脊柱结核的靶向治疗研究;(3)研究表明pRNA3WJ-siLNA(Mce4a)-aptamer(CD40)纳米微粒的靶向性能良好。